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靶向CDK4胞内抗体的抑瘤效应及其作用机制研究

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靶向CDK4胞内抗体的抑瘤效应及其作用机制研究

作者：赵佳亮吉林大学

学位级别：硕士

癌症是一种严重危害人类生命健康的恶性疾病,现有的临床治疗策略仍存在毒副作用、易耐药等限制,亟待开发新的治疗癌症的有效方法。持续的不受控制的细胞分裂是癌症的典型特征。异常活化的CDKs(cyclin-dependent kinases)会导致细胞不受... 详细信息

癌症是一种严重危害人类生命健康的恶性疾病,现有的临床治疗策略仍存在毒副作用、易耐药等限制,亟待开发新的治疗癌症的有效方法。持续的不受控制的细胞分裂是癌症的典型特征。异常活化的CDKs(cyclin-dependent kinases)会导致细胞不受控制的增殖以及基因组和染色体的不稳定性。研究表明,CDK4,作为细胞周期G1/S期转换的限速因子,在多种肿瘤细胞中被过度表达及活化,与肿瘤发生、发展密切相关,已成为肿瘤治疗的一个强有力的靶点。抗体分子以其高特异性和高亲和性的优势,已成为肿瘤等疾病治疗药物研发关注的热点。近年来发展起来的胞内抗体(intrabody or intracellular antibody)技术是一种敲除细胞内特定抗原功能的新型抗体技术。越来越多的证据表明,该技术不仅是揭示细胞内蛋白质功能的重要工具,而且对于多种疾病的临床治疗也具有巨大的应用潜力。抗体发挥作用依赖于抗原-抗体复合物的表位-对位界面上的氨基酸间特异性相互作用,从而阻断抗原和正常底物或相互作用因子之间的结合途径使抗原失活,进而消除或阻止抗原的功能,因此抗原和抗体之间的相互作用模式涉及抗体药物的作用机制。鉴于此,利用胞内抗体技术制备靶向失活细胞内CDK4的抗体并揭示抗原-抗体作用机制,将为靶向CDK4的胞内抗体肿瘤治疗奠定基础。在本研究中,将从半合成人源单链抗体(sc Fv)噬菌体文库中获得的靶向CDK4人源单链抗体基因AK2进行原核表达、纯化与表征,结果表明,成功制备了能够特异性结合CDK4的人源单链抗体AK2。随后我们构建了细胞核定位型靶向CDK4胞内抗体NLS-AK2。通过一系列抗肿瘤效应分析,结果表明NLSAK2的表达能够显著抑制肿瘤细胞的增殖,引起细胞周期G1期阻滞,显著诱导细胞凋亡,并能够抑制体外肿瘤细胞的迁移、侵袭和浸润能力。接下来通过抗原表位预测、同源建模和分子对接等计算机模拟方法,并结合抗原-抗体结合活性分析实验,探究AK2与CDK4的相互作用模式。结果表明,CDK4的S52、R55、C135、Q188、S189和T190位点很可能参与了AK2识别的CDK4表位的形成。进一步探究了AK2发挥抗肿瘤效应的作用机制,通过免疫共沉淀和Western blot实验结果表明,NLS-AK2的表达能够抑制肿瘤细胞内CDK4与cyclin D1的结合,并能够降低Rb蛋白的磷酸化水平。实时定量PCR结果显示,NLS-AK2的表达下调了促进肿瘤细胞增殖和转移的相关基因的表达水平。综上所述,本研究成功制备了能够特异性结合CDK4的人源单链抗体AK2及具有良好抗肿瘤活性的核定位型靶向CDK4胞内抗体NLS-AK2。NLS-AK2作用机制可能是通过与位于CDK4的细胞周期蛋白结合元件PISTVRE基序中的S52和R55位点,以及催化区域的C135、Q188、S189和T190位点相互作用,进而阻碍CDK4-cyclin D1激酶复合物的形成及活化,抑制底物Rb蛋白的磷酸化,从而导致下游一系列与肿瘤细胞增殖、迁移等相关基因表达水平的改变,最终发挥抑瘤效应。本研究为以CDK4为靶点的胞内抗体肿瘤治疗提供了理论基础和实验依据。

关键词：癌症 CDK4 胞内抗体抑瘤效应抗原表位分子对接

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胞内抗体技术及医学应用

生物化学与生物物理进展 1996年第5期23卷 386-390页

作者：周春水甄永苏中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所

胞内抗体技术是近年来随抗体工程技术发展起来的一项新型基因治疗方法．它将单链抗体表达于非淋巴细胞内，并使之定向分布于细胞核、细胞浆或内质网等部位，特异性阻断、干扰分布于该部位的大分子物质生物活性或加工分泌过程．实验证明... 详细信息

胞内抗体技术是近年来随抗体工程技术发展起来的一项新型基因治疗方法．它将单链抗体表达于非淋巴细胞内，并使之定向分布于细胞核、细胞浆或内质网等部位，特异性阻断、干扰分布于该部位的大分子物质生物活性或加工分泌过程．实验证明该技术能抑制生长因子受体的表达，灭活原癌基因蛋白，抑制病毒复制．在生物科学及医学研究中具有很大应用潜力．

关键词：抗体工程胞内抗体单链抗体基因治疗

靶向CDK4胞内抗体抑制黑色素瘤的生长和转移

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靶向CDK4胞内抗体抑制黑色素瘤的生长和转移

作者：张彤吉林大学

学位级别：硕士

黑色素瘤是一类源于黑色素细胞的恶性肿瘤,在全世界范围内的发生率逐渐提高,对于早期发现的黑色素瘤可通过临床手术切除,但术后易复发,而对于晚期及转移型黑色素瘤仍需要有效的治疗方法,因此探究新的黑色素瘤治疗方法对人类健康具有重... 详细信息

黑色素瘤是一类源于黑色素细胞的恶性肿瘤,在全世界范围内的发生率逐渐提高,对于早期发现的黑色素瘤可通过临床手术切除,但术后易复发,而对于晚期及转移型黑色素瘤仍需要有效的治疗方法,因此探究新的黑色素瘤治疗方法对人类健康具有重要的科学价值和意义。细胞周期的失调会导致细胞恶性增殖,进而引发肿瘤。CDK4是细胞周期调控中的重要分子,其与Cyclin D1相互作用形成Cyclin D1-CDK4复合物,进而催化Rb蛋白的磷酸化,释放E2F转录因子,使细胞周期从G1期进入到S期,目前在多种肿瘤和癌症中已经发现了CDK4的过表达,而且CDK4已成为肿瘤治疗的重要靶点。胞内抗体是一种新型的免疫治疗策略,其基因片段可以通过载体递送到细胞内,进而在细胞内表达,靶向结合细胞内的抗原,抑制靶蛋白的活性。本课题组在前期已经成功制备了可特异性与CDK4蛋白结合的单链抗体AK,并将其基因片段与核定位信号序列NLS相连,成功制备了靶向细胞内CDK4的胞内抗体NLS-AK。通过前期实验研究,已经证明NLS-AK可抑制宫颈癌细胞、肝癌细胞和乳腺癌细胞的生长和增殖,但对黑色素瘤的治疗效果和机制尚不清楚。本实验在体外细胞水平,分析了靶向CDK4胞内抗体NLS-AK对三株黑色素瘤细胞(B16-F0、B16-F10、A375)增殖和迁移的抑制效应,并在动物水平探究了以B16-F10为荷瘤细胞建立的动物模型的治疗效果,得到如下结果:免疫共沉淀和Western blot实验结果表明,NLS-AK在黑色素瘤细胞内有效表达并特异性与CDK4蛋白相互作用;间接免疫荧光实验结果表明,NLS-AK与CDK4在细胞核内共定位;MTT、流式细胞术结果显示,NLS-AK抑制黑色素瘤细胞的生长和增殖,并促进黑色素瘤细胞的凋亡;划痕“伤口愈合”实验和Transwell实验结果表明,NLS-AK抑制黑色素瘤细胞的迁移和侵袭;动物荷瘤治疗实验结果进一步表明,NLS-AK在体内抑制黑色素瘤的生长和转移;接下来还通过Q-PCR和Western blot实验探究了NLS-AK对黑色素瘤细胞内与肿瘤增殖和侵袭相关m RNA和蛋白的影响。综上所述,靶向CDK4胞内抗体NLS-AK能够在体内外有效抑制黑色素瘤细胞的生长和迁移。本研究为靶向CDK4胞内抗体治疗黑色素瘤提供了实验依据,也为靶向CDK4的黑色素瘤治疗提供了新思路。

关键词： CDK4 黑色素瘤胞内抗体肿瘤生长肿瘤转移

AAV介导的抗狂犬病毒胞内抗体及其PROTAC分子的功能研究

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AAV介导的抗狂犬病毒胞内抗体及其PROTAC分子的功能研究

作者：贾亭昆明理工大学

学位级别：硕士

狂犬病毒编码5个结构蛋白,包括核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)糖蛋白(G)和转录酶大蛋白(L),是一种不分节段的单股负链RNA病毒。人一旦感染狂犬病毒并出现临床症状,死亡率可达100%。因此,是威胁人类健康的一个重要疾病,这使得针对狂... 详细信息

狂犬病毒编码5个结构蛋白,包括核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)糖蛋白(G)和转录酶大蛋白(L),是一种不分节段的单股负链RNA病毒。人一旦感染狂犬病毒并出现临床症状,死亡率可达100%。因此,是威胁人类健康的一个重要疾病,这使得针对狂犬病的药物研发变得十分迫切。胞内抗体为重组抗体片段,能在细胞内表达,是免疫治疗新策略之一,它们的基因片段可由载体递送到细胞中进行表达,然后在细胞中与抗原相结合,抑制靶蛋白活性。单链抗体是构成胞内抗体最常用的抗体片段形式,已经有很多的证据表明,胞内抗体具有巨大的临床潜力。因此,本实验构建了抗狂犬病毒N蛋白与G蛋白的胞内抗体及其PROTACs,为了使得胞内抗体及其PROTACs可以在体内长期分泌表达,本试验选择了腺相关病毒作为载体,以期能达到预防狂犬病的目的。第一部分:运用分子克隆技术构建pLVX-Puro-CVS-G重组质粒,转化后将阳性克隆进行DNA测序分析,对测序成功的菌液进行扩培,通过Western Blot以及间接免疫荧光实验验证了 pLVX-Puro-CVS-G蛋白的表达,随后用嘌呤霉素筛选到稳定表达CVS-G的N2a细胞系。第二部分:制备抗狂犬病毒单克隆抗体。将灭活的RABV的CVS毒株的BALB/c乳鼠脑组织研磨上清液作为抗原免疫小鼠,增强免疫后,小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,用间接免疫荧光法(IFA)检测阳性克隆,经过3次阳性筛选与亚克隆,得到抗狂犬病毒的特异性抗体。通过Western blot检测、酶联免疫测定、免疫荧光等方法对单克隆细胞进行鉴定,采用细胞ELISA及荧光抗体中和实验对单克隆抗体的中和活性进行检测,应用免疫PCR检测单克隆抗体对狂犬病毒粒子的识别效果。最终,获得4株抗RABV的单克隆抗体,其中,3株识别狂犬病毒的G蛋白,且这3株抗体均具有识别病毒粒子以及中和病毒的能力,为后续实验奠定了基础,以及为免疫检测实验提供了必要的抗体工具。第三部分:抗狂犬病毒胞内抗体及其PROTAC分子的制备及过表达验证,以前期实验室筛选得到的抗狂犬病毒N蛋白单克隆抗体1N1,以及本次试验筛选得到的1B1、1D4抗狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体为基础,克隆出单克隆抗体重链与轻链可变区基因,并通过Linker相连,以pAAV-MCS为表达载体,在轻链的C端加入了 Myc标签,构建了表达抗狂犬病毒N蛋白的胞内抗体pAAV-scFv1N1-Myc,以及抗狂犬病毒G蛋白的胞内抗体pAAV-scFv1B1-Myc、pAAV-scFv1D4-Myc。同时,以蛋白降解靶向嵌合体技术为基础,在胞内抗体的C端加了 PROTAC序列,以期能够对病毒以及病毒蛋白起到降解的作用。将构建好并测序成功的胞内抗体及其加了 PROTAC序列的重组质粒通过脂质体转染试剂转入到N2a细胞以及293T细胞中,通过免疫荧光以及WB成功验证了胞内抗体及加了PROTAC序列的胞内抗体分子的表达。第四部分:通过激光共聚焦以及免疫共沉淀在细胞层面验证了构建的胞内抗体及其PROTACs分子均能与病毒以及病毒蛋白发生相互作用。用RABV的CVS毒株感染过表达了胞内抗体及其PROTACs分子的N2a细胞上清中的病毒滴度,结果证明,胞内抗体以及其PROTACs分子在24 h时对病毒有明显的抑制作用。随后,包装了能够表达抗狂犬病毒N蛋白及G蛋白的胞内抗体及其PROTACs重组质粒的血脑屏障透过型重组腺相关病毒(rAAV-scFv1N1-Myc、rAAV-scFv1N1-Myc-PROTAC、rAAV-scFv1B1-Myc、rAAV-scFv1B1-Myc-PROTAC、rAAV-scFv1D4-Myc、rAAV-scFv1D4-Myc-PROTAC),同时,设置了阴性对照组(rAAV-MCS)。最后,进行病毒的纯化与滴度测定,以BALB/c小鼠及C57/BL6小鼠为模型,将纯化后的重组腺相关病毒以1011copies/只小鼠,通过尾静脉注射入小鼠体内,两周后,对注射过重组腺相关病毒的小鼠攻毒,观察小鼠的生存期。本研究构建了稳定表达CVS-G的N2a细胞系,成功制备出了抗RABV单克隆抗体,并在此基础上制备了胞内抗体及其PROTACs的胞内抗体分子。以能够透过血脑屏障的重组腺相关病毒为载体,对靶向N蛋白与G蛋白的胞内抗体及其PROTACs分子进行表达,包装了具有血脑屏障穿透能力的重组腺相关病毒,并在体内与体外对其抗狂犬病毒活性进行评价,为狂犬病的免疫治疗提供了新思路。

关键词：狂犬病毒胞内抗体单克隆抗体蛋白降解靶向嵌合体技术重组腺相关病毒

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胞内抗体和胞内因子技术与疾病的分子治疗

华西药学杂志 2009年第1期24卷 99-101页

作者：傅刘鹏马伟峰张彦东蔡绍晖暨南大学药学院广东广州510632 南方医科大学公共卫生与热带医学学院广东广州510515

胞内抗体和胞内因子技术是一种新颖的基因治疗策略,也是用于表型敲除研究的又一有力工具。胞内抗体/因子通过基因重组技术在细胞内表达并被定位于特定的亚细胞器中,能够特异性地结合细胞内靶分子,进而影响靶分子的加工或分泌过程及其生... 详细信息

胞内抗体和胞内因子技术是一种新颖的基因治疗策略,也是用于表型敲除研究的又一有力工具。胞内抗体/因子通过基因重组技术在细胞内表达并被定位于特定的亚细胞器中,能够特异性地结合细胞内靶分子,进而影响靶分子的加工或分泌过程及其生物学效应,已在人艾滋病、恶性肿瘤、移植排斥和神经变性等疾病的分子治疗领域彰显出潜在的应用前景。

关键词：胞内抗体胞内因子分子治疗

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胞内抗体肿瘤基因治疗

科学通报 2000年第12期45卷 1233-1235页

作者：邵荣光甄永苏中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所北京100050

自杂交瘤和单克隆抗体技术问世以来, 人们一直尝试将该技术用于肿瘤治疗. 抗体工程的进展使得人们能够对抗体分子进行改造, 研制具有高亲和力和特异结合力的基因工程抗体.

关键词：胞内抗体肿瘤基因治疗基因工程抗体

抗ABL酪氨酸激酶区胞内抗体对K562细胞在裸鼠体内生长的影响

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中国医学科学院学报 2002年第1期24卷 11-14页

作者：徐冬宋俊敏呼莹郭虹曹德骏汪萍刘辉赵春华中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室天津300020

目的观察人慢性粒细胞白血病细胞转导抗ＡＢＬ蛋白酪氨酸激酶区胞内抗体基因后，对其在裸鼠体内生长的影响。方法应用基因重组技术构建逆转录病毒载体ＭＳＣＶ－ｉｂＥ－ＩＲＥＳ－ｅＧＦＰ，将胞内抗体基因转导Ｋ５６２细胞，观察胞内... 详细信息

目的观察人慢性粒细胞白血病细胞转导抗ＡＢＬ蛋白酪氨酸激酶区胞内抗体基因后，对其在裸鼠体内生长的影响。方法应用基因重组技术构建逆转录病毒载体ＭＳＣＶ－ｉｂＥ－ＩＲＥＳ－ｅＧＦＰ，将胞内抗体基因转导Ｋ５６２细胞，观察胞内抗体的表达和细胞内ｃ－ＡＢＬ及ＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白酪氨酸激酶活性的变化；将表达胞内抗体的细胞与对照组Ｋ５６２细胞及转导空载体的细胞分别移植裸鼠，动态观察肿瘤的生长。结果获得表达胞内抗体基因的细胞模型：Ｋ５６２－ｉｂＥ，其靶蛋白酪氨酸激酶活性明显受抑。移植裸鼠后第１４，２１，２８天肿瘤体积均小于对照组的１／２。结论转导抗ＡＢＬ蛋白酪氨酸激酶区胞内抗体的细胞在裸鼠体内生长明显受抑制，这可能与胞内抗体显著抑制细胞内ＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白酪氨酸激酶活性，阻断ＢＣＲ／ＡＢＬ信号途径，促进细胞凋亡，降低了细胞的体内致肿瘤性有关。

关键词：胞内抗体 K562细胞 BCR/ABL 酪氨酸激酶致肿瘤性慢性粒细胞白血病裸鼠体内生长

9.1C3胞内抗体基因的克隆及其对9.1C3分子表达的抑制作用

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中华微生物学和免疫学杂志 2001年第1期21卷 58-61页

作者：欧阳为明金伯泉夏海滨刘飞李德敏张建平第四军医大学免疫教研室西安710032

目的　获得 9 1C3胞内抗体基因的真核表达载体 ,观察胞内抗体对 9 1C3分子表达的抑制作用 ,为进一步研究 9 1C3分子对NK细胞功能的影响打下基础。方法　设计引物 ,以 9 1C3ScFv基因为模板进行PCR扩增 ,引入蛋白质内质网定位所需的信号肽... 详细信息

目的　获得 9 1C3胞内抗体基因的真核表达载体 ,观察胞内抗体对 9 1C3分子表达的抑制作用 ,为进一步研究 9 1C3分子对NK细胞功能的影响打下基础。方法　设计引物 ,以 9 1C3ScFv基因为模板进行PCR扩增 ,引入蛋白质内质网定位所需的信号肽、KDEL以及作为表达检测标记的E tag序列。回收纯化PCR产物 ,酶切后连接到pUC19载体上 ,并进行序列测定。序列正确后切下胞内抗体基因片段 ,重组到真核表达载体pRc/CMV中 ,酶切鉴定后用DEAE dextran方法瞬时转染真核细胞COS7,用胞内染色和Westernblot方法检测胞内抗体的表达。接着用Lipofectamine把胞内抗体基因转入 9 1C3阳性的Jurkat细胞 ,用FCM观察胞内抗体对 9 1C3分子表达的影响。结果　DNA序列测定证明 ,通过PCR成功地为 9 1C3ScFv引入了内质网定位所需的信号肽、KDEL及E tag序列 ,成功地构建了胞内抗体真核表达载体 ,通过胞内染色方法和Westernblot证明胞内抗体在COS7中得到表达。转入Jurkat细胞后发现胞内抗体能下调 9 1C3分子的表达水平。结论　以 9 1C3ScFv基因为模板PCR扩增得到 9 1C3胞内抗体基因 ,并构建了真核表达载体。

关键词：聚合酶链反应 SCFV 胞内抗体表达载体 JURKAT细胞

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胞内抗体研究进展及临床应用前景

现代免疫学 2012年第4期32卷 343-347页

作者：吴标赵国屏王颖上海交通大学医学院上海市免疫学研究所上海200025 上海人类基因组研究中心上海市疾病与健康基因组重点实验室上海20120

胞内抗体(intracellular antibody,intrabody)是一类在细胞内表达、特异性地靶向胞内抗原以期实现对相应功能的调节甚至阻断的新型基因工程抗体。最常见的胞内抗体形式为单链抗体(ScFv)。通过相应定位信号肽序列,胞内抗体能定位于胞浆... 详细信息

胞内抗体(intracellular antibody,intrabody)是一类在细胞内表达、特异性地靶向胞内抗原以期实现对相应功能的调节甚至阻断的新型基因工程抗体。最常见的胞内抗体形式为单链抗体(ScFv)。通过相应定位信号肽序列,胞内抗体能定位于胞浆、胞核、内质网、线粒体、高尔基体、细胞膜和过氧化酶体等各种细胞器,以实现对靶标抗原的功能性调控。其应用也由早先的干扰病毒复制和抑制肿瘤生长,逐渐拓展至治疗中枢神经系统退行性疾病、自身免疫病以及抑制免疫排斥等方面。本文对胞内抗体的作用机制、筛选策略、优缺点、应用及跨膜抗体作一综述。

关键词：胞内抗体单链抗体跨膜抗体 PTD