检索结果-南通市图书馆

作者：吴晓莉华中农业大学

学位级别：硕士

胆固醇25羟化酶（CH25H）是一种定位在内质网膜的羟化酶,其主要功能是催化体内过剩的胆固醇,产生可溶性的25-羟基胆固醇（25HC）,25HC可以通过调控核受体和固醇调节元件结合蛋白（SREBP）来控制胆固醇生物合成,从而减轻体内胆固醇的积... 详细信息

胆固醇25羟化酶（CH25H）是一种定位在内质网膜的羟化酶,其主要功能是催化体内过剩的胆固醇,产生可溶性的25-羟基胆固醇（25HC）,25HC可以通过调控核受体和固醇调节元件结合蛋白（SREBP）来控制胆固醇生物合成,从而减轻体内胆固醇的积累。近年来的研究还发现,CH25H是一种广泛的抗病毒宿主限制性因子,通过催化合成的25HC阻止病毒与细胞之间的膜融合,进而抑制病毒侵入。例如,25HC可显著抑制人类免疫缺陷病毒（HIV）、水泡性口炎病毒（VSV）、人类疱疹病毒（HSV）等病毒的增殖。猪δ冠状病毒（PDCoV）主要引起新生仔猪的呕吐、腹泻、脱水甚至死亡,是一种新发现的猪肠道冠状病毒,对养猪业造成了较大的经济损失。研究报道25HC处理降低了猪肺器官中PRRSV滴度,同时表现出良好的保护作用。据此,研究围绕CH25H对PDCoV增殖的影响及机制展开。本研究通过分析PDCoV感染后细胞CH25H的表达,研究CH25H及其酶活突变体对PDCoV增殖的影响,证实PDCoV感染诱导CH25H表达,CH25H可抑制PDCoV增殖但不完全依赖于其酶活。主要研究内容如下:***感染上调细胞内CH25H的表达将不同剂量的PDCoV（0.25 MOI,0.5 MOI,1.0 MOI）感染猪小肠上皮细胞（IPIFX）,通过q RT-PCR和Western blot分析,发现PDCoV感染后12 h（hpi）,CH25H的m RNA和蛋白水平均显著上调,且呈剂量依赖性。同时,分析了PDCoV（MOI=1）感染IPI-FX细胞后不同时间（6 hpi,12 hpi,18 hpi）CH25H m RNA和蛋白水平的变化,发现感染后6 h CH25H m RNA和蛋白水平无显著变化,但感染后12 h和18h CH25H的m RNA和蛋白水平均显著上调。***25H抑制PDCoV增殖为了确定CH25H及其酶活突变体（CH25H-M）对PDCoV增殖的影响,将CH25H和CH25H-M的真核表达质粒分别转染IPI-FX细胞,然后接种PDCoV（MOI=0.5）,通过q RT-PCR、空斑实验和间接免疫荧光实验检测PDCoV感染后12 h和18 h的增殖情况。发现超表达CH25H和CH25H-M均能显著抑制PDCoV的增殖,但CH25HM的抑制作用显著低于CH25H,表明CH25H可以抑制PDCoV增殖,但不完全依赖于其酶活。为了进一步确定CH25H是否是一种抗PDCoV感染的宿主限制性因子,采用特异性si RNA干扰IPI-FX细胞CH25H的表达,然后接种PDCoV（MOI=0.5）,通过q RT-PCR和空斑实验检测PDCoV感染后18 h的增殖情况。发现干扰细胞的CH25H表达显著促进PDCoV增殖,表明CH25H是一种抗PDCoV感染的宿主限制性因子。3.25HC抑制PDCoV增殖进一步分析CH25H的催化产物25HC对PDCoV增殖的影响。将25HC（12.5μmol/L）预处理细胞IPI-FX细胞8 h,然后接种PDCoV（MOI=0.5）,通过q RT-PCR、空斑实验和间接免疫荧光实验检测PDCoV感染后12 h和18 h的增殖情况。发现25HC处理显著抑制PDCoV的增殖,进一步证实CH25H可通过其酶活作用抑制PDCoV增殖。4.25HC抑制PDCoV的侵入为了确定25HC作用于PDCoV复制周期的具体环节,分析了25HC对PDCoV的吸附、侵入、复制、释放的影响,发现25HC可抑制PDCoV的侵入,但对吸附、复制和释放环节均没有显著影响,而且25HC在体外也不能直接灭活PDCoV。这些结果进一步表明25HC可能通过修饰细胞膜抑制PDCoV感染。

关键词：胆固醇25羟化酶猪δ冠状病毒 25-羟基胆固醇病毒复制

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胆固醇-25-羟化酶和厚朴酚对猪流行性腹泻病毒复制的影响

胆固醇-25-羟化酶和厚朴酚对猪流行性腹泻病毒复制的影响

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作者：张云航南京农业大学

学位级别：硕士

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是一种单股正链RNA病毒,冠状病毒科的成员。PEDV基因组全长约28kb,由5’UTR,3’UTR和七个开放阅读框（ORFs）组成,ORFs编码两个多蛋白（pp1a和pp1b）、S蛋白、N蛋白、E蛋白、ORF3和M蛋白。PEDV首先侵入猪的小... 详细信息

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是一种单股正链RNA病毒,冠状病毒科的成员。PEDV基因组全长约28kb,由5’UTR,3’UTR和七个开放阅读框（ORFs）组成,ORFs编码两个多蛋白（pp1a和pp1b）、S蛋白、N蛋白、E蛋白、ORF3和M蛋白。PEDV首先侵入猪的小肠上皮细胞,致使猪发生急性水样腹泻,脱水,厌食和呕吐。胆固醇25羟化酶（CH25H）是宿主限制性因子,通过其酶活性将胆固醇羟化形成25羟化胆固醇（25HC）。本研究通过表达和干扰CH25H来进一步证明了 CH25H对PEDV的复制有明显的抑制作用,之后研究了其具体的作用机理。厚朴酚（magnolol）是一种天然药物的提取物,本研究通过在Vero细胞上的实验,验证了其对PEDV有明显的抑制作用。1、CH25H抑制PEDV复制的机制研究在研究中发现PEDV感染的Vero细胞中CH25H的mRNA水平随着接毒时间的延长而明显下降,用IFN-α刺激Vero细胞,CH25H的mRNA水平并无显著地变化,说明其在Vero细胞上并非是干扰素刺激基因。为了研究在Vero细胞中CH25H对PEDV复制的影响,通过转染真核表达质粒和小干扰RNA干扰的方法,证明了 CH25H可显著抑制PEDV的复制,同时我们也发现CH25H的酶活性产物25HC也具有显著的抗PEDV的作用,并且呈现剂量依赖性的关系。为了探究25HC影响病毒入侵的具体环节,通过qRT-PCR的方法检验25HC对病毒的吸附、入胞、复制、释放过程的影响,结果证明25HC能够显著抑制病毒入胞的过程。同时,研究也发现25HC对PEDV具有广谱的抗病毒作用,其对经典毒株（CV777）,缺失毒株（PEDVSH）和流行毒株（PEDVMS和PEDVYZ）均存在抑制作用。为了检验酶活性是否会影响CH25H的抗病毒活性,通过点突变的方法构建缺失酶活性CH25H突变体质粒（CH25H-M）,即不能产生25HC,过表达结果表明CH25H-M仍然能够抑制PEDV的复制。为了进一步探究CH25H的抗病毒机制,通过蛋白质谱的方法寻找到了关键蛋白Dermcidin（DCD）,并且过表达DCD可以促进PEDV的感染。然而,共转CH25H和DCD时,我们惊奇的发现CH25H可以以剂量依赖性的方式降解DCD,并且不依赖于CH25H的酶活性。为了研究CH25H是通过何种途径降解DCD的,研究中选择了蛋白酶体抑制剂,凋亡途径抑制剂和自噬溶酶体途径抑制剂,结果显示CH25H可通过自噬溶酶体途径降解DCD。最后,在ST细胞探究了 CH25H及25HC对与PEDV同科的另一种猪冠状病毒-猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的影响,结果表明CH25H和25HC对TGEV的感染也存在抑制作用。本研究首次揭示宿主限制因子CH25H对PEDV感染的抑制作用,并解析了相关机制。2、Magnolol对PEDV在Vero细胞中复制的作用首先进行FDA-Approved药库中的88种药在Vero细胞上对PEDV影响的筛选。通过第一步筛选出对PEDV有抑制作用的三种药物,分别为Magnolol、（+）-Usniacin 和 Parthenolide。首先用 CCK-8 测定了 Magnolol 和（+）-Usniacin 在浓度30 μM以下对Vero细胞并无毒性作用,然后采用剂量依赖法来测定了 Magnolol对PEDV的抑制作用,通过Western blotting、qRT-PCR、等方法测定出随着Magnolol的剂量增加,对PEDV的抑制效果也越来越明显。为了研究Magnolol是否对PEDV具有广谱的抗病毒作用,选用PEDV毒株包括经典株（CV777）,缺失株（PEDV SH）和变异株（PEDV MS和PEDV YZ）,实验结果表明Magnolol对四种毒株均存在抑制作用。Magnolol在病毒感染过程中,明显阻抑其复制过程。本研究首次揭示了天然提取物Magnolol可抑制PEDV复制,为以后PEDV的防治上提供了新的视野。

关键词：猪流行性腹泻病毒胆固醇25羟化酶 25羟化胆固醇厚朴酚

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大蒜素调节TLR4/MyD88/NF-κB通路改善ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化作用

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中草药 2024年第19期 6636-6644页

作者：徐天舒张芸阳柴王静尹纪元王丽丽刘斌郭淑贞张东伟北京中医药大学中医学院北京中医药大学中药学院

目的基于Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）/髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88,MyD88）/核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）通路探讨大蒜素对动脉粥样硬化小鼠的作用及其机制。方法 24只ApoE-/-小鼠随机分为模型组、阿托伐他汀（2.6 mg/kg）组和大蒜素（20 mg/kg）组，每组8只，给予高脂饲料喂养8周。另取8只C57BL/6N野生型小鼠作为对照组，给予普通饲料喂养。给予药物干预9周后，利用油红O染色观察小鼠主动脉斑块面积，苏木素-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色观察小鼠肝脏病理变化；利用生化法检测小鼠血清总胆固醇（total cholesterol,TC）、三酰甘油（triglycerides,TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）水平及天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性，检测肝脏TC、TG、游离胆固醇（free cholesterol,FC）水平；利用ELISA法检测小鼠血清25-羟基胆固醇（25-hydroxycholesterol,25-HC）、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）水平；利用Western blotting检测肝脏中胆固醇25羟化酶（cholesterol25 hydroxylase,CH25H）、TLR4、NF-κB、磷酸化NF-κB（phosphorylated NF-κB,p-NF-κB）、MyD88、IL-1β蛋白表达。结果大蒜素能显著抑制高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠主动脉斑块形成和肝脏的脂肪变性（P25-HC、IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及动脉粥样硬化指数（P25H、TLR4、MyD88、p-NF-κB和IL-1β蛋白表达（P25H水平以及抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路有关。

关键词：大蒜素动脉粥样硬化炎症反应胆固醇25羟化酶 TLR4/MyD88/NF-κB通路

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对虾含脂肪酸羟化酶结构域蛋白的抗病毒作用机理研究

对虾含脂肪酸羟化酶结构域蛋白的抗病毒作用机理研究

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作者：朱小旭山东大学

学位级别：硕士

脂肪酸羟化酶超家族包含了多个亚家族,其中包括胆固醇25羟化酶（Cholesterol 25-hydroxylase,CH25H）和含脂肪酸羟化酶结构域蛋白质2（Fatty acid hydroxylase domain containing protein 2,FAXDC2）。CH25H 催化胆固醇氧化形成可溶的25羟基胆固醇（25HC）,该胆固醇具有抑制病毒感染功能。目前,所有关于CH25H的研究主要限制在脊椎动物中,在无脊椎动物中未发现该基因。FAXDC2在脊椎动物和无脊椎动物中均有发现,但功能仍然未知。在本研究中,我们从日本囊对虾（Marsupenaeusjaponicus）中鉴定出两个含脂肪酸羟化酶结构域蛋白质2样分子,并将它们命名为FAXDC2-like A（FAXDC2-LA）和FAXDC2-like B（FAXDC2-LB）。在受白斑综合症病毒（WSSV）感染的对虾中,Faxdc2-1a和Faxdc2-1b明显上调表达。利用RNA干扰技术敲低Faxdc2-la和Faxdc2-lb表达后,25HC含量明显下降,WSSV复制显著增加。注射或口服25HC后,对虾中的病毒含量显著降低,而对虾的成活率明显提高。所有结果都表明,FAXDC2-Ls的作用类似于脊椎动物的CH25H,并通过其酶促产物25HC在对虾抗病毒反应中发挥重要作用。机制上,Faxdc2-ls是JAK/STAT通路的靶基因,其通过Vago5-JAK/STAT-FAXDC2-25HC通路发挥对虾的抗病毒功能,类似于脊椎动物中IFN-JAK/STAT-CH25H-25HC通路。同时,我们还发现FAXDC2-LA和FAXDC2-LB胞内部分都可以与WSSV囊膜蛋白VP26结合,表明FAXDC2-Ls可能通过与WSSV囊膜蛋白发生相互作用来进一步抑制病毒的增殖。该研究为无脊椎动物干扰素系统的存在提供了新的证据。这也为虾类养殖中WSSV的防治提供了一种新的策略和候选药物。

关键词：日本囊对虾含脂肪酸羟化酶结构域蛋白2 胆固醇25羟化酶 25羟基胆固醇 Vago JAK/STAT 白斑综合征病毒

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