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肽聚糖水解酶基因缺失对解淀粉芽胞杆菌生长及产碱性蛋白酶的影响

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生物工程学报 2021年

作者：徐小健朱宝悦李昕悦张金方刘文龙路福平李玉天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室山东隆科特酶制剂有限公司

为了探究肽聚糖水解酶对解淀粉芽胞杆菌Bacillusamyloliquefaciens生物量以及碱性蛋白酶产量的影响，对解淀粉芽胞杆菌TCCC111018中的5个肽聚糖水解酶基因（lytC、lytD、lytE、lytF、lytG）分别进行敲除。通过分析对比基因缺失前后的生... 详细信息

为了探究肽聚糖水解酶对解淀粉芽胞杆菌Bacillusamyloliquefaciens生物量以及碱性蛋白酶产量的影响，对解淀粉芽胞杆菌TCCC111018中的5个肽聚糖水解酶基因（lytC、lytD、lytE、lytF、lytG）分别进行敲除。通过分析对比基因缺失前后的生物量以及碱性蛋白酶酶活力发现，敲除菌株BAΔlytC、BAΔlytE在60 h的活菌数分别达到1.67×10;CFU/mL、1.44×10;CFU/mL，分别高出对照菌株BAΔupp 32.5%、14.3%；其碱性蛋白酶酶活力分别为20 263.82 U/mL、17 264.75 U/mL，比对照菌株分别提高了43.1%、27.3%。该结果表明肽聚糖水解酶的缺失可以有效提高解淀粉芽胞杆菌菌体生物量和碱性蛋白酶的酶活力，为进一步构建工业酶生产宿主提供了新的思路和研究策略。

关键词：解淀粉芽胞杆菌肽聚糖水解酶基因敲除生物量碱性蛋白酶

新型肽聚糖水解酶抑制剂二苯脲化合物抗多重耐药屎肠球菌的作用机制研究

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新型肽聚糖水解酶抑制剂二苯脲化合物抗多重耐药屎肠球菌的作用机...

作者：谢云凤安徽理工大学

学位级别：硕士

肠球菌(Enterococci)是寄居在人和动物肠道内的条件致病菌,能够造成严重的腹腔感染、尿路感染和血液感染等。肠球菌耐药性现象日益加重,并通过食物、环境等进行传播感染。已成为院内感染的主要病原体。生物膜的形成是增强肠球菌耐药性... 详细信息

肠球菌(Enterococci)是寄居在人和动物肠道内的条件致病菌,能够造成严重的腹腔感染、尿路感染和血液感染等。肠球菌耐药性现象日益加重,并通过食物、环境等进行传播感染。已成为院内感染的主要病原体。生物膜的形成是增强肠球菌耐药性的重要原因之一,寻找消除生物膜的新型药物已成为治疗临床多药耐药肠球菌的新热点。目的明确二苯脲类化合物、屎肠球菌(Enterococcus faecium)细胞壁肽聚糖水解酶和生物膜三者之间的关系。为屎肠球菌肽聚糖水解酶抑制剂的研究提供新的理论依据,为临床治疗多重耐药菌提供新思路。方法1.化合物的合成和抗菌筛选:化学合成12个二苯脲类衍生物,选择革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和白色念珠菌进行抗菌筛选,测定最小抑菌浓度(MIC)。细胞毒实验测定对人肝癌细胞株Hep G-2的细胞毒性,筛选出活性最好、毒性较低的二苯脲化合物。2.筛选临床分离株成膜能力强弱菌株:从9株临床分离的屎肠球菌株中,通过结晶紫法(CV)检测9株屎肠球菌菌株的成膜能力。3.检测二苯脲化合物抗屎肠球菌生物膜活性:用CV法和XTT法(二苯基四氮唑溴盐)定量检测化合物ZJ-2的最低生物膜清除浓度(MBEC),扫描电镜观察化合物ZJ-2作用下的生物膜的清除情况,透射电镜观察化合物ZJ-2对屎肠球菌细胞壁的作用。4.化合物ZJ-2诱导耐药实验:采用肉汤稀释连续传代抗性诱导实验研究化合物ZJ-2的耐药倾向性。5.肽聚糖水解酶及生物膜聚集相关基因检测:通过q RT-PCR试验观察化合物ZJ-2对屎肠球菌肽聚糖水解酶及生物膜粘附聚集相关基因的调控能力。6.抑制肠道模型中炎症因子IL-6和TNF-α的实验研究:建立体外模拟的肠道模型检测屎肠球菌诱导后的Caco-2细胞中细胞因子IL-6和TNF-α的水平,观察阳性对照与化合物ZJ-2处理后的炎症因子表达水平。7.化合物ZJ-2的体内抗菌治疗研究:建立屎肠球菌诱导建立的的小鼠腹膜炎/败血症模型,2小时后皮下给予化合物ZJ-2、万古霉素及利奈唑胺给药治疗,并在不同时间段取小鼠眼眶后丛静脉血,测试小鼠细菌载量和血液炎症因子表达,观察肝脏组织的病理变化,评价化合物ZJ-2体内抗菌效果。结果1.二苯脲类衍生物均表现出良好的窄谱抗菌活性,仅对革兰氏阳性菌有效,其中化合物ZJ-2抗耐药屎肠球菌活性最好(MIC为0.78μmol/L),并且对肝癌细胞株Hep G-2的生存影响小,毒性低。2.筛选出具有形成生物膜能力高的的屎肠球菌菌株E3101,对红霉素、氯霉素和庆大霉素等均耐药。3.诱导耐药实验结果显示:与利奈唑胺相比,化合物ZJ-2在屎肠球菌传代第18代后不再改变,化合物ZJ-2对屎肠球菌表现出更低的抗性诱导倾向。4.化合物ZJ-2抗E3101菌株的MBEC为0.78-1.56μmol/L,优于利奈唑胺。XTT法显示细菌以代谢活性呈剂量依赖降低。扫描电镜显示化合物ZJ-2能抑制并清除屎肠球菌生物膜,透视电镜显示化合物ZJ-2可以破坏细胞壁,细胞内容物外溢,使得细菌死亡。5.化合物ZJ-2作用下E3101菌株肽聚糖水解酶sag A和atl A的基因表达量分别显著下降到17.0%和28.5%,生物膜聚集相关基因agg和esp的表达量分别降低了82.0%和81.9%,分子对接显示化合物ZJ-2能与Sag A的特异性结合,靶标明确。6.体外模拟肠道模型中,炎症因子IL-6和TNF-α呈剂量依赖性的下降,表明化合物ZJ-2能抑制屎肠球菌引起的炎症反应,有效的保护肠道上皮的完整性。7.小鼠腹腔感染模型的实验数据表明,化合物ZJ-2能显著降低小鼠血液中屎肠球菌E3101的载量和细胞因子的水平,减轻小鼠肝脏组织细胞坏死以及炎症细胞浸润情况,药效作用优于临床抗生素利奈唑胺。结论本研究阐明肽聚糖水解酶抑制剂ZJ-2靶向屎肠球菌细胞壁靶蛋白Sag A的作用机制,为清除生物膜药物的研制提供新思路,为临床联合治疗屎肠球菌感染提供一种新策略。图[14]表[6]参[52]

关键词：屎肠球菌二苯脲生物膜肽聚糖水解酶 SagA

氮离子注入选育高自溶干酪乳杆菌及其肽聚糖水解酶的RT-qPCR分析

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食品与发酵工业 2020年第1期46卷 43-49页

作者：崔文明吕加平王小鹏赵莉君祝超智张秋会李苗云赵改名河南农业大学食品科学技术学院河南郑州450002 农业部农产品加工与质量控制重点开放实验室中国农业科学院农产品加工研究所北京100193

通过采用低能N^+注入对干酪乳杆菌116-a进行诱变,以筛选得到高自溶的干酪乳酸菌突变体,并采用实时荧光定量PCR检测N-乙酰胞壁质酶和N-乙酰氨基葡糖胺糖苷酶在野生菌体和突变体中的表达差异。结果显示:经过离子能量30 keV N^+注入诱变,... 详细信息

通过采用低能N^+注入对干酪乳杆菌116-a进行诱变,以筛选得到高自溶的干酪乳酸菌突变体,并采用实时荧光定量PCR检测N-乙酰胞壁质酶和N-乙酰氨基葡糖胺糖苷酶在野生菌体和突变体中的表达差异。结果显示:经过离子能量30 keV N^+注入诱变,在注入剂量0.5×10^15 ions/cm^2时,筛选得到遗传稳定性良好的最大正突变菌株,其自溶度为56.3%,最大正突变菌株自溶度比野生型菌株的自溶度提高了25.7%。实时荧光定量PCR检测发现,N-乙酰氨基葡糖苷酶和N-乙酰胞壁质酶在突变体中的表达量比野生菌体中的表达量均有所上调,其中N-乙酰氨基葡糖苷酶表达量上调了约55倍,而N-乙酰胞壁质酶的表达量仅上调2.8倍。因此,N-乙酰氨基葡糖苷酶在干酪乳杆菌116-a自溶中起着重要作用,该酶表达量的上调可以有效提高菌体的自溶。

关键词：干酪乳酸菌自溶离子注入肽聚糖水解酶

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肽聚糖水解酶——一种潜在抗葡萄球菌的武器

畜牧兽医科技信息 2016年第3期32卷 7-9页

作者：王英利赵克强河北省沧州市动物疫病预防控制中心河北沧州061000

金黄色葡萄球菌是引起人类和动物食源性疾病的主要病因。由于耐抗生素葡萄球菌的出现,使得这一类疾病的治疗越发困难,迫切需要发展一些替代类药物。大量研究表明,肽聚糖水解酶(PHs)可控制和治疗这一菌属引起的感染。肽聚糖水解酶可快速... 详细信息

金黄色葡萄球菌是引起人类和动物食源性疾病的主要病因。由于耐抗生素葡萄球菌的出现,使得这一类疾病的治疗越发困难,迫切需要发展一些替代类药物。大量研究表明,肽聚糖水解酶(PHs)可控制和治疗这一菌属引起的感染。肽聚糖水解酶可快速的水解并引起金黄色葡萄糖球菌死亡。通常PHs对水解金黄色葡萄球菌的细胞壁成分具有较高的特异性,也能够裂解其他种类的葡萄球菌,对人类表皮葡萄球菌和其他的葡萄球菌同样具有杀灭作用。一些PHs可增强抗生素的杀菌和抑菌活性,因此,PHs无论是在酶学方面还是在抗生素方面都可被视为一种潜在的药物。一些研究表明,可以用异源性的表达系统来产生该酶类,如大肠杆菌表达系统。但我们更需要发展更有效的大规模生产此类酶的技术。

关键词：葡萄球菌金黄色葡萄球菌抗生素抗性肽聚糖水解酶

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芽胞杆菌肽聚糖水解酶的功能研究进展

生物技术通报 2015年第2期31卷 45-52页

作者：王丹丹郭淑元北京理工大学生命学院北京100081

长久以来,肽聚糖水解酶都被认为是破坏性的角色,如噬菌体利用它裂解宿主以释放病毒粒子,一些细菌分泌它来溶解竞争对手等。但近几年来,随着研究的不断深入发现,在细胞生长代谢过程中,它的积极作用更为重要。综述了芽胞杆菌肽聚糖水解酶... 详细信息

长久以来,肽聚糖水解酶都被认为是破坏性的角色,如噬菌体利用它裂解宿主以释放病毒粒子,一些细菌分泌它来溶解竞争对手等。但近几年来,随着研究的不断深入发现,在细胞生长代谢过程中,它的积极作用更为重要。综述了芽胞杆菌肽聚糖水解酶在细胞整个生命过程中的功能,包括细胞生长、分裂、能动性、芽胞形成及萌发、蛋白分泌、信息传递、先天性免疫以及致病性各个方面,为研究芽胞杆菌及其他微生物中肽聚糖水解酶和细胞代谢调节奠定了理论基础。

关键词：芽胞杆菌肽聚糖肽聚糖水解酶功能

大肠杆菌O157中肽聚糖水解酶MpaA的克隆、表达、纯化及晶体学研究

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河北大学学报（自然科学版） 2016年第4期36卷 412-416页

作者：马银良刘爽崔亚琦康现江刘秀华河北大学生命科学学院河北保定071002

采用分子克隆方法将来源于大肠杆菌O157的mpaA基因构建入pET-21b(+)表达载体.诱导MpaA蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中高效表达,通过Ni亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析三步法纯化得到高纯度蛋白.使用气象扩散法进行蛋白质晶... 详细信息

采用分子克隆方法将来源于大肠杆菌O157的mpaA基因构建入pET-21b(+)表达载体.诱导MpaA蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中高效表达,通过Ni亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析三步法纯化得到高纯度蛋白.使用气象扩散法进行蛋白质晶体生长的初步筛选与优化,得到MpaA蛋白质单晶,并使用X射线衍射仪进行衍射数据的收集与处理.MpaA晶体分辨率为0.26nm,属于P31空间群,晶胞参数为a=5.989 3nm,b=5.989 3nm,c=12.987 0nm,β=90.000°.MpaA晶体衍射数据的收集为后续结构解析和催化机制的阐明提供了基础.

关键词：大肠杆菌O157 肽聚糖水解酶 MpaA 晶体

日照海域分泌肽聚糖水解酶菌株的筛选、初步鉴定及抑菌活性测定

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济宁医学院学报 2020年第4期43卷 233-237页

作者：李淼侯灵芝徐兴浩王肖肖郑明灿刘昂济宁医学院基础医学院济宁272067

目的筛选能分泌肽聚糖水解酶的菌株并测定其抑菌活性,为研发新型抗菌药物提供素材。方法从日照海域潮间带沉积物中筛选能水解肽聚糖,并且可以在以金黄色葡萄球菌为唯一营养物的液体培养基中生长的菌株,16S rRNA基因序列测定并同源性比对... 详细信息

目的筛选能分泌肽聚糖水解酶的菌株并测定其抑菌活性,为研发新型抗菌药物提供素材。方法从日照海域潮间带沉积物中筛选能水解肽聚糖,并且可以在以金黄色葡萄球菌为唯一营养物的液体培养基中生长的菌株,16S rRNA基因序列测定并同源性比对,确定其分类地位;诱导产酶,离心培养液得到的上清作为粗酶液,观测粗酶液对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。结果筛选出8株分泌肽聚糖水解酶且能够在以金黄色葡萄球菌为唯一营养物的液体培养基中生长的菌株。16S rRNA基因序列同源性比对分析表明,这8株菌均属于芽孢杆菌属。其粗酶液菌均对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。与对照组相比,粗酶液处理后菌落形成单位下降比率在(61.9±7.7)%^(95.0±2.4)%。显微镜下观察,粗酶液处理后的葡萄球菌轮廓变得不清晰,数量减少。结论海洋潮间带中存在能够分泌肽聚糖水解酶的菌株,本实验筛选的8株菌粗酶液均表现出较强的抑制金黄色葡萄球菌的活性,且粗酶液对金黄色葡萄球菌有裂解活性。

关键词：肽聚糖水解酶溶菌酶金黄色葡萄球菌芽孢杆菌

耻垢分枝杆菌MSMEG_6281过表达对菌株生长和形态的影响

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微生物学通报 2016年第7期43卷 1547-1554页

作者：姜涛任丽萍臧师竹张翠丽辛毅大连医科大学生物技术系辽宁大连116044 大连医科大学生物化学与分子生物学教研室辽宁大连116044

【目的】耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis mc2155,mc2155)MSMEG_6281为结核分枝杆菌自溶素Rv3717的同源蛋白,通过建立过表达MSMEG_6281的耻垢分枝杆菌菌株,推测该蛋白对耻垢分枝杆菌肽聚糖代谢的影响。【方法】利用RT-PCR方法检... 详细信息

【目的】耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis mc2155,mc2155)MSMEG_6281为结核分枝杆菌自溶素Rv3717的同源蛋白,通过建立过表达MSMEG_6281的耻垢分枝杆菌菌株,推测该蛋白对耻垢分枝杆菌肽聚糖代谢的影响。【方法】利用RT-PCR方法检测乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)作用后MSMEG_6281基因的表达变化;以耻垢分枝杆菌基因组DNA为模板,采用PCR技术克隆MSMEG_6281基因,构建分枝杆菌表达质粒p VV16-MSMEG_6281,进一步建立MSMEG_6281过表达的耻垢分枝杆菌菌株;利用生长曲线检测MSMEG_6281过表达对耻垢分枝杆菌生长的影响;利用扫描电子显微镜分析MSMEG_6281过表达引起的耻垢分枝杆菌形态变化。【结果】EMB处理引起MSMEG_6281基因表达上调;构建了过表达MSMGE_6281的耻垢分枝杆菌菌株(mc2155/p VV16-MSMEG_6281);过表达MSMGE_6281的耻垢分枝杆菌生长缓慢,菌体形态由短杆状转变为长杆状。【结论】MSMGE_6281的过表达可改变耻垢分枝杆菌形态。MSMGE_6281的功能与细胞壁肽聚糖水解相关,在mc2155细胞壁形态维持方面发挥重要作用。

关键词： MSMEG_6281 耻垢分枝杆菌细胞形态肽聚糖水解酶

CwlM对结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌自溶能力以及生物被膜形成的影响

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CwlM对结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌自溶能力以及生物被膜形成的影...

作者：张巧丽吉林大学

学位级别：硕士

结核病(Tuberculosis,TB)是一种高发病率和高传染性的疾病,主要是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起。2013结核患病人数900万有150万人死于此病。2015年结核病新增人数960万,较2013年有增长趋势;在我国耐药结核在所... 详细信息

结核病(Tuberculosis,TB)是一种高发病率和高传染性的疾病,主要是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起。2013结核患病人数900万有150万人死于此病。2015年结核病新增人数960万,较2013年有增长趋势;在我国耐药结核在所报道的TB病例中所占比例较大,结核分枝杆菌耐药性问题已成为国内外结核病防治工作者关注的焦点之一。形成生物被膜是细菌耐药的重要机制之一,结核分枝杆菌能够在体内外形成生物膜,而这些生物膜内的菌体在高浓度抗生素作用下依然能够生存。已有报道表明,胞外DNA(Extracellular DNA,e DNA)和自溶素基因在生物被膜形成过程中起着关键的作用,而自溶素基因和肽聚糖水解酶密切相关。结核分枝杆菌Rv3915基因和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,M.smegmatis)中MSMEG935(统称cwl M基因)分别编码各自菌体的CwlM蛋白,结核分枝杆菌的CwlM(简称CwlMTB)和耻垢分枝杆菌的CwlM(简称CwlMms)是肽聚糖水解酶的酰胺酶,能够水解细菌细胞壁。鉴于CwlM具有水解细菌细胞壁的作用,临床应用的潜在价值巨大,故CwlM对细菌自溶和生物被膜的影响能力值得深入研究。在本研究中,我们成功构建了耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌的体外生物被膜模型,通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测cwl M基因分别在MTB和M.smegmatis生物被膜中的表达;原核表达和纯化结核分枝杆菌CwlMTB和耻垢分枝杆菌CwlMms蛋白,探讨重组CwlMms和CwlMTB分别对各自菌体的自溶和生物被膜形成表型的影响;最后通过构建耻垢分枝杆菌的cwl M缺失株进一步来确证内源CwlMms对其自溶和生物被膜的影响。首先,采用q RT-PCR实技术,分别检测了耻垢分支杆菌MSMEG935基因和结核分枝杆菌中Rv3915基因在生物被膜形成过程中的表达情况。结果显示,MSMEG935基因在耻垢生物被膜形成中期表达量比浮游状态极显著上调(上调3倍,p0.05);在生物被膜形成的中期和成熟期,Rv3915基因表达量较浮游菌极显著增加(p酶活性来检测自溶的程度;通过结晶紫定量测定重组CwlMms对耻垢生物被膜的影响和重组CwlMTB对结核生物被膜的影响。结果表明:CwlMms处理增强了耻垢分枝杆菌Mc2155的自溶能力;CwlMTB处理增强了结核分枝杆菌H37Rv的自溶能力;CwlMms显著降低耻垢生物被膜的产量(p<0.001);CwlMTB对结核生物被膜有抑制作用(p<0.05)。最后,通过构建耻垢分枝杆菌的cwl M基因缺失株验证内源CwlM对耻垢分枝杆菌自溶和生物被膜形成的影响。通过利用p PR27温敏性穿梭质粒进行同源重组,我们进行cwl M基因缺失株(MSΔ6935)的构建;通过测定0.1%Triton X-100诱导下Mc2155和MSΔ6935的自溶能力;通过扫描电镜图和荧光显微镜来观察cwl M基因缺失对耻垢生物被膜的两种标志物e DNA和e RNA的影响,观察cwl M基因缺失对生物被膜产量影响。结果表明:筛选到具有卡那基因抗性的菌落,说明cwl M基因缺失株(MSΔ6935)构建成功;对比实验结果显示MSΔ6935菌株较其亲代Mc2155菌株的自溶能力减弱;MSΔ6935比Mc2155的e DNA和e RNA含量减少,说明耻垢分支杆菌CwlMm

关键词：结核分枝杆菌耻垢分枝杆菌肽聚糖水解酶 CwlM 自溶生物被膜