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探讨早衰及非瑟酮的抗衰老效应在肺血管重塑中的作用

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探讨早衰及非瑟酮的抗衰老效应在肺血管重塑中的作用

作者：高雨彤华中科技大学

学位级别：硕士

应激性早衰是机体遭受各种有害损伤诱发的过早性衰老,如香烟烟雾及阿霉素,它们分别是体内试验和体外实验中最常见的应激性早衰刺激。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种衰老性疾病,而肺血管重塑(PVR)是COPD的重要并发症,且与衰老有密切的关... 详细信息

应激性早衰是机体遭受各种有害损伤诱发的过早性衰老,如香烟烟雾及阿霉素,它们分别是体内试验和体外实验中最常见的应激性早衰刺激。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种衰老性疾病,而肺血管重塑(PVR)是COPD的重要并发症,且与衰老有密切的关系。非瑟酮(Fisetin)是一种黄酮类物质,具有广泛的生物学效应。多项研究证实非瑟酮有抗氧化,抗衰老的作用,能够缓解各种疾病的进程。本实验拟探讨应激性早衰与肺血管重塑的关系,同时研究非瑟酮的抗衰老作用对肺血管重塑的影响。第一部分:探讨应激性早衰与肺血管重塑的关系目的:在相关肺疾病体内实验的研究中,吸烟是引发肺组织应激性早衰的常见原因,应激性早衰的进程中涉及各种分子机制,而早衰必定会发生DNA的损伤。Nrf2/ARE通路通过抑制氧化应激从而保护DNA免受损伤,是目前发现最重要的抗氧化通路。由于香烟刺激可以导致肺血管结构的改变。因此,在本部分实验中探讨应激性早衰与肺血管重塑的关系,及此过程中Nrf2/ARE抗氧化通路的表达情况。方法:筛选年龄相仿且无明显肺功能下降的长期吸烟组及终身未吸烟组的临床标本,两组标本均可见肺小动脉不同程度的肌化,并且长期吸烟组肺小动脉的肌化程度明显高于终身未吸烟组。采用蜡块提取总RNA和QPCR法检测两组肺组织标本抗氧化通路Nrf2/ARE的基因表达情况。另外建立长期吸烟诱发应激性早衰的动物模型,采用Western blot法检测实验大鼠肺组织中衰老相关蛋白P53、P21、P16的表达及抗氧化通路Nrf2/ARE的蛋白表达情况。结果:长期吸烟的动物模型中,吸烟组大鼠较未吸烟组大鼠肺组织中衰老相关蛋白P53、P21、P16的表达明显增高,伴随着抗氧化通路Nrf2/ARE的表达减弱。在人体临床标本的研究中,长期吸烟组肺组织中抗氧化因子Nrf2、NQO-1的表达降低,而HO-1无明显变化。结论:肺血管重塑的发生发展,伴随着应激性早衰和抗氧化通路Nrf2/ARE的表达下降。第二部分:研究非瑟酮的抗衰老效应在肺血管重塑中的作用目的:非瑟酮(Fisetin)是一种黄酮类物质,大量存在于蔬菜和水果中,具有抗氧化、抗衰老等作用。衰老细胞分泌衰老相关分泌表型(SASP),包括炎症因子和细胞生长因子,其中细胞生长因子会促进肺动脉平滑肌细胞的增殖,从而导致肺血管重塑。阿霉素与香烟提取物同属应激性早衰刺激,其比香烟提取物性质更稳定,效果更明显,更广泛的应用于细胞衰老模型的建立。因此,在本部分体外实验中研究非瑟酮抑制阿霉素诱发的应激性早衰在肺血管重塑中的作用。方法:培养人肺动脉内皮细胞(HPAEC)及人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)。采用CCK8法检测不同浓度的Fisetin(5μM、10μM、20μM、30μM、50μM、100μM)对HPAEC增殖的影响。细胞培养后用阿霉素诱发HPAEC衰老,并应用衰老相关的β半乳糖苷酶活性染色,P53/P21及P16的蛋白水平和流式细胞术观察细胞周期等方法验证Fisetin对HPAEC衰老进程的影响。采用Western blot法检测非瑟酮刺激HPAEC后HO-1的表达,Nrf2的核转入情况及P38 MAPK通路的磷酸化表达。应用HO-1瞬时沉默si RNA及P38抑制剂SB 203580分析Fisetin对细胞抗衰老作用的相关分子机制。最后利用HPAEC不同处理组的条件培养基培养人肺动脉平滑肌细胞,并用CCK-8法测量HPASMC的增殖效应。结果:CCK8实验证实,当Fisetin浓度≤20μM时,Fisetin对人肺动脉内皮细胞无明显毒性。此外,衰老相关的β半乳糖苷酶染色实验证实Fisetin减少了阿霉素诱发的衰老染色。流式细胞术检测衰老周期证实,相对阿霉素组的S期百分比,Fisetin预刺激组的S期百分比明显上升。Western blot结果显示,Fisetin抑制了衰老相关蛋白P53/P21及P16的表达。此外,在通路方面,Fisetin促进了P38的磷酸化表达及Nrf2和HO-1的蛋白表达,HO-1瞬时沉默逆转了非瑟酮对细胞的抗衰老作用,同时,P38 MAPK抑制剂SB203580部分消除了非瑟酮诱发的抗衰老作用。最后,相比阿霉素处理组的条件培养基,非瑟酮预处理组的条件培养基减轻了HPASMC的增殖活性。结论:非瑟酮对HPAEC的应激性早衰有保护作用,这种作用通过促进P38 MAPK磷酸化和抗氧化通路Nrf2/HO-1的表达,抑制HPAEC应激性衰老的发生,降低衰老细胞分泌的SASP对HPASMC增殖活性的促进作用,从而缓解肺血管重塑的进程,为以后进一步研究衰老相关的肺血管疾病提供了潜在的参考价值。

关键词：应激性早衰肺血管重塑 Nrf2/HO-1 非瑟酮 P38MAPK

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肺血管重塑中的炎症机制

国际呼吸杂志 2012年第23期32卷 1816-1820页

作者：王晓芳陆慰萱北京积水潭医院呼吸内科 100035 中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院呼吸科 100730

肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）是一组由异源性疾病和不同发病机制引起的以肺血管阻力持续增加为特征的临床——病理生理综合征。肺血管收缩、血管壁重塑以及血栓形成是造成PH肺血管阻力增加的主要原因，其中由细胞增殖及血... 详细信息

肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）是一组由异源性疾病和不同发病机制引起的以肺血管阻力持续增加为特征的临床——病理生理综合征。肺血管收缩、血管壁重塑以及血栓形成是造成PH肺血管阻力增加的主要原因，其中由细胞增殖及血管重塑导致的肺动脉闭塞被认为是PH发病机制及病理改变的主要特征。对于一些特定类型的PH，炎症机制在肺血管重塑中起重要作用。本文将对肺血管重塑以及相关炎症机制的研究进展作一综述。

关键词：肺动脉高压肺血管重塑炎症

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硝苯地平对低温诱发的肉鸡肺血管重塑的影响

西北农业学报 2015年第5期24卷 1-5页

作者：张建军孙茂红赵立红董世山安健乔健北京农学院动物科学技术学院北京102206 河北北方学院牧业工程系河北张家口075131 中国农业大学动物医学院北京100193 河北农业大学动物科技学院河北保定071001

为探讨钙拮抗剂硝苯地平对低温诱发的肉鸡肺血管重塑的影响,动态观察肺小动脉血管中膜平滑肌增殖及管腔面积的改变。150只AA商品代肉仔鸡常规育雏,15日龄随机分为3组：常温（22-24℃）对照组、低温（9-11℃）组、低温（9-11℃）硝苯地... 详细信息

为探讨钙拮抗剂硝苯地平对低温诱发的肉鸡肺血管重塑的影响,动态观察肺小动脉血管中膜平滑肌增殖及管腔面积的改变。150只AA商品代肉仔鸡常规育雏,15日龄随机分为3组：常温（22-24℃）对照组、低温（9-11℃）组、低温（9-11℃）硝苯地平组。分别于低温处理后2周（28日龄）、3周（36日龄）、4周（44日龄）随机各抽取10只测定肺动脉压（PAP）,同时取肺组织做石蜡切片,以Weigert弹力纤维染色,图像分析测定肺小动脉外径和内径、管腔面积和管总面积,计算相对中膜厚度（mMTPA）及管壁面积/管总面积（WA/TA）。结果表明：（1）硝苯地平抑制了低温诱发的肉鸡肺动脉压的升高,28日龄、36日龄和44日龄,硝苯地平组mPAP显著低于低温组（P〈0.05）;（2）硝苯地平能抑制肺小动脉中膜平滑肌增生,表现在28日龄、36日龄和44日龄时,硝苯地平组50-100μm的肺小动脉mMTPA显著低于低温组（P〈0.05）,100-200μm肺小动脉的组间差异与此类似;（3）硝苯地平抑制肺小动脉血管壁的增厚,3个日龄的硝苯地平组肺小动脉WA/TA显著低于低温组（P〈0.05）。可见,硝苯地平抑制低温诱发的肉鸡肺动脉高压和肺血管重塑。

关键词：肉鸡硝苯地平低温肺血管重塑

肺动脉平滑肌细胞与低氧性肺血管重塑形成机制

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中国动脉硬化杂志 2013年第2期21卷 177-181页

作者：张凌云高宝安三峡大学第一临床医学院宜昌市中心人民医院呼吸内科湖北省宜昌市443003

低氧条件下肺血管收缩、重塑,继而导致肺血管的持续对抗,其中以中膜增厚为主的肺血管重塑是导致低氧性肺动脉高压持续不可逆性病理改变的重要因素。肺动脉平滑肌细胞是肺动脉中膜的主要构成部分,慢性缺氧条件下由于各种活性介质及细胞... 详细信息

低氧条件下肺血管收缩、重塑,继而导致肺血管的持续对抗,其中以中膜增厚为主的肺血管重塑是导致低氧性肺动脉高压持续不可逆性病理改变的重要因素。肺动脉平滑肌细胞是肺动脉中膜的主要构成部分,慢性缺氧条件下由于各种活性介质及细胞生长因子稳态的失衡,肺动脉平滑肌细胞聚集、增殖、肥大及分泌胞外基质;另外,肺动脉平滑肌细胞通过各种信号通路与内膜的内皮细胞及外膜的成纤维细胞相互作用,在低氧性肺血管重塑过程中起着至关重要的作用,本文将对肺动脉平滑肌细胞与低氧性肺血管重塑形成机制的最新研究概况作一综述。

关键词：肺动脉平滑肌细胞低氧性肺动脉高压肺血管重塑

阻塞性睡眠呼吸暂停合并肺动脉高压肺血管重塑的机制

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国际呼吸杂志 2021年第16期41卷 1266-1271页

作者：李晓宁魏丽缪雅芳王在岩张泽明上海健康医学院附属周浦医院呼吸科 201318

阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)是一种多数由上呼吸道,特别是鼻、咽部位的解剖学狭窄导致的,在睡眠状态下反复出现呼吸暂停和/或低通气、睡眠中断,从而使机体发生一系列病理生理改变的临床综合征。OSA是一种常见疾病和多发病,对人类的健康危... 详细信息

阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)是一种多数由上呼吸道,特别是鼻、咽部位的解剖学狭窄导致的,在睡眠状态下反复出现呼吸暂停和/或低通气、睡眠中断,从而使机体发生一系列病理生理改变的临床综合征。OSA是一种常见疾病和多发病,对人类的健康危害极大,尤其是OSA合并肺动脉高压患者预后差。OSA与肺动脉高压密切相关,OSA既可以是肺动脉高压的病因也可以是合并症,因此其发病机制复杂。研究证实,肺动脉重塑在OSA的肺动脉高压的发生、发展过程中起着重要的作用。本综述旨在对近年来肺动脉重塑在OSA合并肺动脉高压形成过程中主要机制的进展进行总结,为临床进一步研究提供参考。

关键词：睡眠呼吸暂停,阻塞性高血压,肺性,微RNAs 肺血管重塑内皮间质转化

TLR4与COPD肺血管重塑相互关系的研究进展

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实用医学杂志 2016年第2期32卷 318-320页

作者：王鹏雁王昌明蒋明桂林医学院附属医院呼吸内科 541004

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是高发生、高死亡，严重影响患者生存质量，并带来沉重经济负担的疾病。肺动脉高压与患者预后密切相关。早期无缺氧的COPD肺组织中。已存在明显的血管炎性改变和病理学重建，但肺血管重塑的具体发病机制尚未完... 详细信息

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是高发生、高死亡，严重影响患者生存质量，并带来沉重经济负担的疾病。肺动脉高压与患者预后密切相关。早期无缺氧的COPD肺组织中。已存在明显的血管炎性改变和病理学重建，但肺血管重塑的具体发病机制尚未完全明了。Toll样受体4（TLR4）是机体介导天然免疫转向获得性免疫的桥梁,与COPD的发病密切相关。

关键词：肺血管重塑 COPD TLR4 慢性阻塞性肺疾病 Toll样受体发病机制肺动脉高压获得性免疫

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一氧化氮对肉鸡肺血管重塑影响的研究进展

动物医学进展 2012年第8期33卷 86-89页

作者：刘林艳姜义宝杨玉荣梁宏德河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002

肺血管重塑是肉鸡肺动脉高压综合征的重要病理学变化特征,虽然对其形成的机制尚未完全清楚,但众多细胞因子在其形成过程中起重要作用已得到共识。一氧化氮作为一种信号物质,在血管扩张、细胞增殖与凋亡、内皮素分泌与合成以及抗氧化等... 详细信息

肺血管重塑是肉鸡肺动脉高压综合征的重要病理学变化特征,虽然对其形成的机制尚未完全清楚,但众多细胞因子在其形成过程中起重要作用已得到共识。一氧化氮作为一种信号物质,在血管扩张、细胞增殖与凋亡、内皮素分泌与合成以及抗氧化等过程中发挥着重要的调控作用,显示了其在抑制肉鸡肺血管重塑、预防和治疗肺动脉高压发生方面有着广阔的应用前景。

关键词：一氧化氮肺动脉高压肺血管重塑肉鸡

TGF-β1在烟雾暴露大鼠肺血管的表达及其与肺血管重塑的关系研究

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TGF-β1在烟雾暴露大鼠肺血管的表达及其与肺血管重塑的关系研究

作者：王焕华中科技大学

学位级别：硕士

目的:通过制备大鼠长期吸烟模型,观察转化生长因子-β1(TGF-β1)在其肺组织中表达的变化,探讨肺血管重塑形成的原因及机制。方法:将60只健康SD雄性大鼠随机分5组,分别为对照组、烟雾暴露2w(S-2W)、4w(S-4W)、8w(S-8W)、12w(S-12W)组。... 详细信息

目的:通过制备大鼠长期吸烟模型,观察转化生长因子-β1(TGF-β1)在其肺组织中表达的变化,探讨肺血管重塑形成的原因及机制。方法:将60只健康SD雄性大鼠随机分5组,分别为对照组、烟雾暴露2w(S-2W)、4w(S-4W)、8w(S-8W)、12w(S-12W)组。苏木精-伊红(HE)染色观察和检测肺小动脉管壁厚度的变化(WT%),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)染色法分析肺小动脉肌化的程度;免疫组化法观察和评估增殖细胞核抗原(PCNA)和TGF-β1蛋白在肺小动脉中的相对表达;荧光定量PCR(RT-PCR)检测肺小动脉TGF-β1 mRNA表达量。结果:(1)随被动吸烟时间延长,模型组各组肺小动脉管壁厚度和肺小动脉肌化程度均较对照组显著增加。(2)模型组PCNA和TGF-β1蛋白表达水平均较对照组升高,且相邻模型组之间存在显著差异。(3)与对照组相比,模型组各组TGF-β1 mRNA表达量显著增加,其中S-4W、S-8W和S-12W组之间均具有显著差异。(4)TGF-β1 mRNA及蛋白表达水平与WT%、完全肌化血管比值及PCNA阳性细胞率呈显著正相关。结论:1.大鼠在被动吸烟早期即出现肺血管重塑,且随被动吸烟时间延长逐渐加重。2.肺小动脉TGF-β1表达随被动吸烟时间延长而增加,表明其可能与香烟烟雾诱导的肺血管重塑有关。3.吸烟可能通过上调肺小动脉TGF-β1的表达,诱导PASMCs增殖,导致肺血管重塑和PAH形成。

关键词： TGF-β1 吸烟肺血管重塑肺动脉高压平滑肌增殖

香烟烟雾抑制Nrf2诱导人肺动脉内皮细胞衰老在肺血管重塑中的作用

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香烟烟雾抑制Nrf2诱导人肺动脉内皮细胞衰老在肺血管重塑中的作用

作者：蔡磊华中科技大学

学位级别：硕士

慢性阻塞性肺部疾病(COPD)的致病原因有很多,但是吸烟在其中占主导地位,COPD患者最严重的并发症是肺动脉高压(PH),PH常常会导致右心衰竭。肺动脉高压最常引起形态学改变就是因平滑肌细胞增殖而导致肺血管结构重塑(PVR),目前PVR的形成机... 详细信息

慢性阻塞性肺部疾病(COPD)的致病原因有很多,但是吸烟在其中占主导地位,COPD患者最严重的并发症是肺动脉高压(PH),PH常常会导致右心衰竭。肺动脉高压最常引起形态学改变就是因平滑肌细胞增殖而导致肺血管结构重塑(PVR),目前PVR的形成机制并不清楚。已知吸烟会刺激细胞产生活性氧族(ROS)并诱导细胞发生衰老以及端粒长度的缩短[1,2],衰老的细胞会分泌衰老相关分泌表型(SASP),SASP中的炎性细胞因子和一些细胞生长因子可诱导肺动脉平滑肌细胞的迁移和增殖。因此,肺血管内皮细胞是一种重要的衰老相关的效应细胞,容易在接触血液的过程中受到血流剪切力和氧化应激的刺激产生内源性的ROS,而且能够分泌多种相关细胞因子,因此在由吸烟引起的血管老化的微环境中起着关键的作用。核呼吸相关因子2(Nrf2)是一种抗氧化和抗衰老的重要DNA结合蛋白,可以调控下游多种抗氧化相关基因的表达直接或间接地对抗氧化应激。Nrf2/ARE途径是目前发现的对抗ROS最重要的信号通路[3]。有研究表明,长期吸烟的COPD患者中Nrf2的表达水平较低,而且此类患者中外周血白细胞的端粒长度较未吸烟的COPD患者明显缩短,提示COPD是一种典型的衰老过程,Nrf2在COPD发病过程中发挥重要作用。目前,关于吸烟对于影响Nrf2的表达及其在PVR中的作用研究较少。第一部分香烟烟雾刺激可以诱导肺动脉内皮细胞DNA损伤以及衰老。目的探究延长香烟烟雾提取物(Cigarette Smoke Extract CSE)刺激的时间对肺动脉内皮细胞(HPAEC)的影响。方法:细胞培养后,香烟烟雾提取物(Cigarette Smoke Extract CSE)刺激不同的时间点,利用流式细胞术观察细胞周期、免疫荧光检测细胞衰老相关蛋白P21、Real-time PCR检测p53和p21基因、flow-fish的方法检测细胞端粒的长度、β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况。结果香烟烟雾刺激72h后与对照组(0h)相比,细胞周期阻滞明显(p肺动脉内皮细胞的衰老和DNA的损伤。第二部分Nrf2在香烟烟雾诱导HPAEC发生衰老过程中的作用。目的:探究香烟烟雾刺激引起HPAEC产生的影响其内在机制以及与nrf2的表达的关系。方法:研究提示随着CSE对HPAEC的刺激,Nrf2表达量是先升高后下降的,12小时时表达量最高,72h时表达量降到最低。为了探讨cse刺激和Nrf2表达的关系,分别采取了三种干预措施,观察作用效果。第一,在刺激12小时对细胞进行si Nrf2的转染,再联合CSE刺激观察细胞的衰老效应;第二,构建Nrf2的质粒并进行转染,转染之后利用CSE刺激细胞,观察72h后相关基因的表达量;第三,利用Nrf2的激活剂t BHQ观察激活Nrf2之后对CSE诱导的细胞衰老的变化。利用western blot和Real-time PCR的方法检测Nrf2及其相关基因DJ-1和下游基因HO-1和NQO1以及衰老相关基因p53、p21的表达量、利用β—半乳糖苷酶染色检测细胞衰老。结果:(1)对细胞进行转染si Nrf2之后,细胞的抗氧化作用下降,CSE刺激12h后,细胞相比于未转染的细胞衰老明显,p53和p21的表达升高。(2)细胞转染Nrf2的质粒后,给予CSE刺激72h发现,细胞的抗氧化作用明显提高,衰老相关基因和蛋白的表达量较低。(3)Nrf2的激活剂t BHQ作用后,给予CSE刺激72h,细胞抗氧化作用同样提高,效应与质粒转染相同。结论:Nrf2在吸烟引起的细胞衰老中具有重要作用,短时间的CSE刺激可以激活Nrf2增强细胞的抗氧化作用,但是随着刺激时间的延长Nrf2的表达下降,细胞逐渐趋于衰老状态。第三部分衰老的HPAEC分泌SASP可诱导肺动脉平滑肌细胞的增殖,促进PVR的形成目的:观察HPAEC在接受CSE刺激衰老后分泌的衰老相关分泌表型(SASP)是否会诱导肺动脉平滑肌细胞的增殖。方法:运用ELISA方法检测了时间梯度影响下的HPAEC的分泌物TNF-α、TGFβ1、MCP-1、IL-6、b FGF的浓度,随着时间的延长SASP的浓度逐渐升高。通过Real-time PCR的方法检测衰老相关分泌表型基因在HPAEC中的表达,制备条件培养基对肺动脉平滑肌细胞进行培养观察,利用CCK8法检测细胞的增殖,Transwell实验方法检测迁移能力,通过流式细胞术和ki-67蛋白的表达两种方法确定HPASMC的增殖与HPAEC细胞中Nrf2的表达之间的关系。结果:随着时间的延长,b FGF、IL-6、IL-8、MCP-1、TNF-α、TGF-β1的表达量升高,24h之内有下降的趋势,48h、72h

关键词：长期吸烟肺血管重塑 Nrf2 衰老相关分泌表型细胞衰老人肺血管平滑肌细胞