香烟烟雾抑制Nrf2诱导人肺动脉内皮细胞衰老在肺血管重塑中的作用
作者单位：华中科技大学
学位级别：硕士
导师姓名：敖启林
授予年度：2016年
主 题：长期吸烟 肺血管重塑 Nrf2 衰老相关分泌表型 细胞衰老 人肺血管平滑肌细胞
摘 要：慢性阻塞性肺部疾病(COPD)的致病原因有很多,但是吸烟在其中占主导地位,COPD患者最严重的并发症是肺动脉高压(PH),PH常常会导致右心衰竭。肺动脉高压最常引起形态学改变就是因平滑肌细胞增殖而导致肺血管结构重塑(PVR),目前PVR的形成机制并不清楚。已知吸烟会刺激细胞产生活性氧族(ROS)并诱导细胞发生衰老以及端粒长度的缩短[1,2],衰老的细胞会分泌衰老相关分泌表型(SASP),SASP中的炎性细胞因子和一些细胞生长因子可诱导肺动脉平滑肌细胞的迁移和增殖。因此,肺血管内皮细胞是一种重要的衰老相关的效应细胞,容易在接触血液的过程中受到血流剪切力和氧化应激的刺激产生内源性的ROS,而且能够分泌多种相关细胞因子,因此在由吸烟引起的血管老化的微环境中起着关键的作用。核呼吸相关因子2(Nrf2)是一种抗氧化和抗衰老的重要DNA结合蛋白,可以调控下游多种抗氧化相关基因的表达直接或间接地对抗氧化应激。Nrf2/ARE途径是目前发现的对抗ROS最重要的信号通路[3]。有研究表明,长期吸烟的COPD患者中Nrf2的表达水平较低,而且此类患者中外周血白细胞的端粒长度较未吸烟的COPD患者明显缩短,提示COPD是一种典型的衰老过程,Nrf2在COPD发病过程中发挥重要作用。目前,关于吸烟对于影响Nrf2的表达及其在PVR中的作用研究较少。第一部分香烟烟雾刺激可以诱导肺动脉内皮细胞DNA损伤以及衰老。目的探究延长香烟烟雾提取物(Cigarette Smoke Extract CSE)刺激的时间对肺动脉内皮细胞(HPAEC)的影响。方法:细胞培养后,香烟烟雾提取物(Cigarette Smoke Extract CSE)刺激不同的时间点,利用流式细胞术观察细胞周期、免疫荧光检测细胞衰老相关蛋白P21、Real-time PCR检测p53和p21基因、flow-fish的方法检测细胞端粒的长度、β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况。结果香烟烟雾刺激72h后与对照组(0h)相比,细胞周期阻滞明显(p0.01);随着时间的延长,细胞的端粒长度逐渐缩短(P0.05);Real-time PCR结果显示衰老相关标记物p53和p21的表达逐渐升高,提示细胞衰老逐渐加重。结论延长香烟烟雾刺激时间加速肺动脉内皮细胞的衰老和DNA的损伤。第二部分Nrf2在香烟烟雾诱导HPAEC发生衰老过程中的作用。目的:探究香烟烟雾刺激引起HPAEC产生的影响其内在机制以及与nrf2的表达的关系。方法:研究提示随着CSE对HPAEC的刺激,Nrf2表达量是先升高后下降的,12小时时表达量最高,72h时表达量降到最低。为了探讨cse刺激和Nrf2表达的关系,分别采取了三种干预措施,观察作用效果。第一,在刺激12小时对细胞进行si Nrf2的转染,再联合CSE刺激观察细胞的衰老效应;第二,构建Nrf2的质粒并进行转染,转染之后利用CSE刺激细胞,观察72h后相关基因的表达量;第三,利用Nrf2的激活剂t BHQ观察激活Nrf2之后对CSE诱导的细胞衰老的变化。利用western blot和Real-time PCR的方法检测Nrf2及其相关基因DJ-1和下游基因HO-1和NQO1以及衰老相关基因p53、p21的表达量、利用β—半乳糖苷酶染色检测细胞衰老。结果:(1)对细胞进行转染si Nrf2之后,细胞的抗氧化作用下降,CSE刺激12h后,细胞相比于未转染的细胞衰老明显,p53和p21的表达升高。(2)细胞转染Nrf2的质粒后,给予CSE刺激72h发现,细胞的抗氧化作用明显提高,衰老相关基因和蛋白的表达量较低。(3)Nrf2的激活剂t BHQ作用后,给予CSE刺激72h,细胞抗氧化作用同样提高,效应与质粒转染相同。结论:Nrf2在吸烟引起的细胞衰老中具有重要作用,短时间的CSE刺激可以激活Nrf2增强细胞的抗氧化作用,但是随着刺激时间的延长Nrf2的表达下降,细胞逐渐趋于衰老状态。第三部分衰老的HPAEC分泌SASP可诱导肺动脉平滑肌细胞的增殖,促进PVR的形成目的:观察HPAEC在接受CSE刺激衰老后分泌的衰老相关分泌表型(SASP)是否会诱导肺动脉平滑肌细胞的增殖。方法:运用ELISA方法检测了时间梯度影响下的HPAEC的分泌物TNF-α、TGFβ1、MCP-1、IL-6、b FGF的浓度,随着时间的延长SASP的浓度逐渐升高。通过Real-time PCR的方法检测衰老相关分泌表型基因在HPAEC中的表达,制备条件培养基对肺动脉平滑肌细胞进行培养观察,利用CCK8法检测细胞的增殖,Transwell实验方法检测迁移能力,通过流式细胞术和ki-67蛋白的表达两种方法确定HPASMC的增殖与HPAEC细胞中Nrf2的表达之间的关系。结果:随着时间的延长,b FGF、IL-6、IL-8、MCP-1、TNF-α、TGF-β1的表达量升高,24h之内有下降的趋势,48h、72h表达量升高明显(p0.01);CCK8检测发现,细胞在条件培养基的刺激下,CSE刺激时间越长的培养基,细胞增殖越明显;条件培养基中72h和48h组细胞的迁移数目较对照组明显升高(p0.05);其中流式细胞术检测细胞周期和ki-67免疫荧光表达显示:与CSE组相比,t BHQ和p-Nrf2转染组细胞增殖较低(p0.05)结论:长时间的CSE刺激细胞产生SASP,诱导肺血管平滑肌细胞的增殖和迁移。
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