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Mn-SOD通过GSK-3β影响HO-1和Drp1的抗氧化应激减轻MTX相关肝细胞损伤

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中南大学学报（医学版） 2022年第9期47卷 1191-1199页

作者：李卓陈梦璇汪苇杭刘其摇李耐萍贺波蒋永芳马静中南大学湘雅二医院眼科长沙410011 中南大学湘雅二医院感染科长沙410011

目的:氨甲蝶呤(methotrexate,MTX)是导致药物性肝损伤最常见的药物,其致病机制与线粒体功能障碍引起的氧化应激有关。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)可以通过清除超氧自由基达到抗氧化应激的作用,含锰超氧化物歧化酶(mangane... 详细信息

目的:氨甲蝶呤(methotrexate,MTX)是导致药物性肝损伤最常见的药物,其致病机制与线粒体功能障碍引起的氧化应激有关。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)可以通过清除超氧自由基达到抗氧化应激的作用,含锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn-SOD)属于SOD的一种。本研究拟观察Mn-SOD是否影响MTX对肝细胞的损伤,并探讨其可能的分子机制。方法:体外培养人肝细胞系L-02,并分为4组:空白对照组(加入同体积无血清培养基)、MTX组(加入40μg/孔MTX)、MTX+NC组(加入40μg/孔MTX+转染空白质粒)和MTX+SOD组(加入40μg/孔MTX+转染Mn-SOD质粒)。分别应用全自动生化仪和real-time RT-PCR法检测每组细胞培养上清的ALT、AST和miR-122的水平,评估各组肝细胞受损伤的程度;使用线粒体超氧化物(mitochondrial superoxide indicator,MitoSOX)荧光探针标记各组细胞内超氧化物,流式细胞术检测细胞凋亡情况;蛋白质印迹法检测细胞中糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3 beta,GSK-3β)、血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)、线粒体分裂蛋白质(dynamin-related protein 1,Drp1)和Mn-SOD的含量。结果:与空白对照组比较,MTX组和MTX+NC组肝细胞培养上清中ALT、AST和miR-122水平明显升高(P细胞术检测结果表明:与空白对照组相比,MTX组和MTX+NC组细胞凋亡明显增加,MTX+SOD组与MTX组和MTX+NC组比较细胞凋亡明显减少(P细胞Mn-SOD、p-GSK-3β和HO-1高水平表达,而MTX组和MTX+NC组细胞Mn-SOD、p-GSK-3β和HO-1比空白对照组明显降低(P细胞内Mn-SOD水平的降低导致超氧化物蓄积,通过GSK-3β影响HO-1和Drp1水平,使线粒体裂解损伤,诱导细胞凋亡,这是MTX引起肝细胞损伤的分子机制之一;将Mn-SOD导入细胞内高表达,可清除药物产生的超氧化物,通过GSK-3β影响HO-1和Drp1水平,从而激活线粒体、保护细胞免受氧化应激损伤,最终抑制肝细胞凋亡。因此,通过外源导入SOD来阻断或逆转MTX相关肝细胞损伤是一条潜在的治疗途径。

关键词：含锰超氧化物歧化酶氨甲蝶呤肝细胞损伤

小柴胡汤对D-GalN/LPS诱导的虎龙杂交石斑鱼肝细胞损伤的保护作用

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南方水产科学 2022年第5期18卷 66-73页

作者：邹翠云陈小晶邬颖欣黄锦雄谭小红胡心月甘松永吴锦辉仲恺农业工程学院动物科技学院/广东省水环境与水产品安全工程技术研究中心/广州市水产病害与水禽养殖重点实验室广东广州510225 广东省农业技术推广中心广东惠州516081

为探讨小柴胡汤对虎龙杂交石斑鱼(Epinephelus lanceolatus♂×E.fuscoguttatus♀)化学性肝细胞损伤的免疫功能影响,用D-氨基半乳糖(D-GalN,20 mmol·L^(–1))和脂多糖(LPS,1μg·mL^(–1))作用肝细胞24 h构建虎龙杂交石斑鱼肝细胞损伤... 详细信息

为探讨小柴胡汤对虎龙杂交石斑鱼(Epinephelus lanceolatus♂×E.fuscoguttatus♀)化学性肝细胞损伤的免疫功能影响,用D-氨基半乳糖(D-GalN,20 mmol·L^(–1))和脂多糖(LPS,1μg·mL^(–1))作用肝细胞24 h构建虎龙杂交石斑鱼肝细胞损伤模型,用不同质量浓度的小柴胡汤(100、200和400μg·mL^(–1))对肝细胞进行前处理[D-氨基半乳糖联合脂多糖(DGalN/LPS)损伤前加药],通过CCK-8法检测肝细胞活力,HE染色观察肝细胞形态,收集细胞上清液检测炎症因子INFγ、COX-2和PGE2的含量,以及细胞沉淀中凋亡和免疫相关基因的表达。结果表明,小柴胡汤可以提高肝细胞的成活率,不同程度地抑制D-GalN/LPS损伤引起的肝细胞培养上清液中INF-γ活性以及COX-2和PGE2含量的升高,降低细胞内乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活性以及细胞凋亡率,对肝细胞结构具有明显的保护作用;同时显著抑制凋亡相关基因caspase-3、caspase-9和P53的上调,促进免疫相关基因TLR3的上调。数据统计分析显示,添加200μg·mL^(–1)小柴胡汤组的抑制效果最明显。综合以上结果,小柴胡汤对虎龙杂交石斑鱼化学性肝损伤有一定的保护作用,可预防肝脏疾病的发生和发展,为鱼类保肝药物研究提供了新的见解。

关键词：小柴胡汤虎龙杂交石斑鱼 D-GalN/LPS 肝细胞损伤

外周血单个核细胞诱导为肝细胞样细胞及初步探讨对乙酰氨基酚作用下的细胞损伤反应

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中华肝脏病杂志 2022年第1期30卷 87-93页

作者：刘萍张彪曾泉陈思文葛晨王卫华王昌正岳文万军解放军医学院北京市100853 中国人民解放军总医院第二医学中心消化内科国家老年疾病临床医学研究中心北京市100853 军事科学院军事医学研究院卫生勤务与血液研究所军事再生医学研究室北京市100850 北京工业大学北京市100124

目的建立外周血单个核细胞诱导肝细胞样细胞的方法,初步探讨其在对乙酰氨基酚(APAP)作用下的细胞损伤反应。方法流式细胞术和免疫荧光法检测外周血分离的单个核细胞表面标志CD45;针对诱导的肝细胞样细胞,倒置显微镜观察细胞形态,实时荧... 详细信息

目的建立外周血单个核细胞诱导肝细胞样细胞的方法,初步探讨其在对乙酰氨基酚(APAP)作用下的细胞损伤反应。方法流式细胞术和免疫荧光法检测外周血分离的单个核细胞表面标志CD45;针对诱导的肝细胞样细胞,倒置显微镜观察细胞形态,实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测肝细胞特异性基因细胞色素P450(CYP)1A2、CYP3A4、CYP2C9、白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)、肝细胞核因子(HNF)4α mRNA的表达水平;免疫荧光法检测肝细胞标志物AFP、HNF4α、ALB在细胞中蛋白的表达水平,生化分析仪检测肝细胞特有的AFP、ALB、尿素的分泌功能,荧光素酶化学发光法检测肝细胞关键药物代谢酶CYP3A4酶活性;肝损伤药物APAP作用肝细胞样细胞后,比色测定法检测肝细胞损伤指标丙氨酸转氨酶(ALT)。采用t检验与秩和检验比较数据间的统计学差异。结果外周血分离的单个核细胞表面标志CD45表达阳性率约98%,诱导第15天细胞形态出现肝细胞样变化;与分离的单个核细胞相比,CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、ALB、AFP、HNF4α mRNA明显升高,AFP、ALB,HNF4α蛋白表达水平均升高,AFP、ALB,尿素的分泌功能增强;与原代肝细胞相比CYP1A2、CYP2C9、AFP、HNF4α mRNA,CYP3A4 mRNA无降低,ALB mRNA较低,AFP、ALB、HNF4α蛋白在细胞中的表达水平无降低,AFP、ALB,尿素的分泌功能无降低。此外肝细胞样细胞产生了与原代肝细胞相似的CYP3A4酶活性;APAP孵育较不含APAP孵育的肝细胞样细胞会释放更多的ALT;在APAP作用下肝细胞样细胞相比分离的单个核细胞ALT释放增加。结论外周血单个核细胞能诱导为具有肝细胞部分特性的肝细胞样细胞,通过诱导具有了肝细胞关键药物代谢酶CYP3A4活性,肝损伤药物APAP作用下,肝细胞样细胞初步体现了肝细胞损伤时ALT分泌的特征。

关键词：外周血单个核细胞诱导肝细胞样细胞肝细胞损伤

肌肽对叔丁基过氧化氢诱导肝细胞损伤的修复作用

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食品与发酵工业 2023年

作者：陈铭罗静宋文奎苏伟明吉宏武广东海洋大学食品科学与技术学院广东省水产品加工与安全重点实验室

肌肽是一种新型的食品补充剂，具有多种生物活性功能，已广泛应用于保健品、功能饮料、美容等领域，但肌肽对肝损伤修复的研究与应用鲜有报道。该研究旨在研究肌肽对肝损伤的修复作用并探究其作用机制。肌肽预处理正常人肝细胞（normal ... 详细信息

肌肽是一种新型的食品补充剂，具有多种生物活性功能，已广泛应用于保健品、功能饮料、美容等领域，但肌肽对肝损伤修复的研究与应用鲜有报道。该研究旨在研究肌肽对肝损伤的修复作用并探究其作用机制。肌肽预处理正常人肝细胞（normal human hepatocyte， L-02）12 h，400 mmol/mL叔丁基过氧化氢（tert butyl hydrogen peroxide， TBHP）处理L-02细胞4 h，细胞计数试剂盒-8检测细胞存活率，试剂盒检测谷丙转氨酶（alanine transaminase， ALT）、谷草转氨酶（aspartate transaminase， AST）、活性氧（reactive oxygen species， ROS）、谷胱甘肽（glutathione， GSH）水平，流氏细胞术检测细胞凋亡，蛋白印迹定量分析氧化信号通路与凋亡信号通路的相关蛋白表达。结果表明，肌肽预处理显著降低了L-02细胞外液ALT、AST活性，抑制ROS形成，提高细胞内GSH含量，显著抑制L-02细胞凋亡，上调核红细胞2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor-2， Nrf2）、醌氧化还原酶1（quinone oxidoreductase 1， NQO1）、血红素氧合酶1（heme oxygenase-1， HO-1）、B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma 2， Bcl-2）的蛋白表达，下调Kelch样ECH关联蛋白1（Kelch like ECH associated protein 1， Keap1）、磷酸化氨基末端激酶（amino-terminal kinases phosphorylation， p-JNK）、胱天蛋白酶3（Caspase-3，Cas-3）的蛋白表达。肌肽通过调控Keap1-Nrf2与JNK-Cas-3信号通路有效修复TBHP诱导的肝细胞损伤。

关键词：肌肽叔丁基过氧化氢肝细胞损伤 L-02细胞氧化应激细胞凋亡 Keap1-Nrf2 JNK-Cas-3

枸杞多糖对Hcy诱导的肝细胞损伤的保护作用及其机制

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解放军医学杂志 2024年

作者：王佩佩岳云曹丽翠李宏伟刘丽李航鹰王晓丽中卫市中医院针灸科宁夏医科大学药学院宁夏回族自治区人民医院中医科银川市第一人民医院中医科

目的　探讨枸杞多糖(LBP)对Hcy诱导的肝细胞损伤的作用及其机制。方法　体外培养正常C3H/An小鼠肝细胞(NCTC 1469)，采用不同浓度的Hcy(0、50、100、200、500 μmol/L)处理NCTC 1469细胞，使用MTT法检测Hcy处理NCTC 1469细胞的最合适浓... 详细信息

目的　探讨枸杞多糖(LBP)对Hcy诱导的肝细胞损伤的作用及其机制。方法　体外培养正常C3H/An小鼠肝细胞(NCTC 1469)，采用不同浓度的Hcy(0、50、100、200、500 μmol/L)处理NCTC 1469细胞，使用MTT法检测Hcy处理NCTC 1469细胞的最合适浓度。取对数生长期细胞，设置：(1)对照组(采用10%马血清的DMEM培养基培养)与Hcy组(采用100 μmol/L Hcy溶液处理48 h)，收集细胞。采用细胞活力染色检测细胞凋亡情况，谷草转氨酶(AST)/谷丙转氨酶(ALT)活性检测试剂盒检测AST、ALT活性，RT-qPCR检测YAP1、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRAN的表达，Western blotting检测YAP1蛋白的表达，巢式甲基化特异性PCR(nMS-PCR)检测YAP1启动子区DNA甲基化率。(2)对照组、LBP组、Hcy组与Hcy+LBP组，LBP组采用4 mg/ml LBP溶液处理2 h，Hcy组、Hcy+LBP采用100 μmol/L Hcy溶液处理48 h，46 h时Hcy+LBP组加入4 mg/ml LBP溶液处理，收集细胞。采用RT-qPCR检测YAP1、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRAN的表达，Western blotting检测YAP1、Bax、Bcl-2蛋白的表达，AST/ALT活性检测试剂盒检测AST、ALT活性。采用生物信息学预测YAP1启动子区DNA甲基化CpG岛。结果　根据MTT法检测结果，选择100 μmol/L Hcy处理NCTC 1469细胞进行后续实验。与对照组比较，Hcy组细胞凋亡率增高(P细胞损伤的关键过程，YAP1启动子区域甲基化的改变可能是Hcy引起YAP1表达变化的分子机制。LBP可通过正向调节YAP1的表达改善Hcy引起的NCTC 1469细胞损伤。

关键词：枸杞多糖同型半胱氨酸肝细胞损伤 DNA甲基化

地参游离酚对CCl_(4)所致肝细胞损伤细胞凋亡、细胞周期及炎症因子的影响

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食品工业科技 2022年第3期43卷 333-340页

作者：李媛丽洪玥孔霄林琳张天阳李望刘青高春燕卢跃红大理大学公共卫生学院云南大理671000 大理白族自治州中医医院云南大理671000 北方民族大学生物科学与工程学院宁夏银川750021

通过体外实验,研究地参游离酚对CCl_(4)所致肝细胞损伤细胞凋亡、细胞周期及炎症因子的影响。采用流式细胞术分析细胞凋亡及细胞周期的分布,采用试剂盒测定肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素8(IL-8)的含量和天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶3(Caspa... 详细信息

通过体外实验,研究地参游离酚对CCl_(4)所致肝细胞损伤细胞凋亡、细胞周期及炎症因子的影响。采用流式细胞术分析细胞凋亡及细胞周期的分布,采用试剂盒测定肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素8(IL-8)的含量和天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)活化程度,同时采用免疫组化检测环氧化酶-2(COX-2)、白介素6(IL-6)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的蛋白表达水平。结果表明,与模型组相比,地参游离酚能显著降低CCl_(4)引起的细胞凋亡,影响细胞周期的分布,能显著降低炎症因子TNF-α、IL-8的含量并阻滞Caspase-3的活化程度(P细胞凋亡、影响细胞周期分布和抑制炎症反应保护CCl_(4)所致的肝细胞损伤。

关键词：地参游离酚四氯化碳肝细胞损伤细胞周期炎症因子

枸杞多糖对乙醇诱导肝细胞损伤的保护作用研究

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天然产物研究与开发 2020年第4期32卷 549-556页

作者：李永盛王茂鹤刘建飞邸多隆刘晔玮魏鉴腾兰州大学公共卫生学院营养与食品卫生学研究所中国科学院兰州化学物理研究所中科院西北特色植物资源化学重点实验室甘肃中医药大学药学院兰州730000

为探讨枸杞多糖(LBPs)对乙醇诱导肝细胞损伤的保护作用。枸杞样品经提取分离得到粗多糖(LBPs0)和不同分子量范围LBPs(LBPs1~LBPs4),利用人正常肝细胞(L-02细胞)评价LBPs对乙醇诱导肝细胞损伤的保护活性:MTT法测定细胞活力,比色法测定细... 详细信息

为探讨枸杞多糖(LBPs)对乙醇诱导肝细胞损伤的保护作用。枸杞样品经提取分离得到粗多糖(LBPs0)和不同分子量范围LBPs(LBPs1~LBPs4),利用人正常肝细胞(L-02细胞)评价LBPs对乙醇诱导肝细胞损伤的保护活性:MTT法测定细胞活力,比色法测定细胞培养液中ALT、AST和LDH的释放,DCFH-DA法测定细胞内活性氧(ROS)水平。结果显示,LBPs在0~200μg/mL间对细胞增殖无抑制或促进作用,其可通过提高细胞活力、降低ALT、AST、LDH的释放和抑制细胞内ROS的产生而发挥对乙醇诱导肝细胞损伤的保护作用。不同分子量范围LBPs的活性不同,LBPs3最强,其次为LBPs4和LBPs2,LBPs1最弱。综上,LBPs可保护乙醇诱导的肝细胞损伤,分子量范围为5~10 kDa的LBPs3的活性最高,本实验结果可为LBPs保护肝损伤功能食品及药物的应用开发提供实验基础和理论指导。

关键词：枸杞多糖分子量范围乙醇肝细胞损伤

AdipoRon改善乙醇致L02肝细胞损伤及脂质沉积的机制

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中国老年学杂志 2022年第13期42卷 3316-3320页

作者：柳立平解从君王海舫李保欣张岁段卫河北医科大学第一医院肝病中心河北石家庄050031

目的探究新型小分子脂联素受体激动剂(AdipoRon)改善乙醇致L02肝细胞损伤及脂质沉积的作用机制。方法使用乙醇致肝细胞半数抑制浓度确立L02细胞损伤模型,将其分成对照组、模型组、低剂量组(15μg/ml)、中剂量组(30μg/ml)及高剂量组(60... 详细信息

目的探究新型小分子脂联素受体激动剂(AdipoRon)改善乙醇致L02肝细胞损伤及脂质沉积的作用机制。方法使用乙醇致肝细胞半数抑制浓度确立L02细胞损伤模型,将其分成对照组、模型组、低剂量组(15μg/ml)、中剂量组(30μg/ml)及高剂量组(60μg/ml),使用MTT法测定细胞活性;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞内丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)-Px活性;油红O染色及qRT-PCR检测细胞脂质代谢能力变化;流式细胞术及Western印迹用于检测细胞线粒体功能变化。结果与模型组比较,中、高剂量组细胞增殖活力、SOD活性显著增强,MDA含量显著降低(P细胞比例、VDAC1及GSH蛋白表达显著升高(P细胞增殖活力、SOD、GSH-Px活性显著增强,MDA含量、SERSP-1c mRNA表达显著降低,PPAR-αmRNA表达、线粒体膜电位正常细胞比例、VDAC1及GSH蛋白表达显著升高(P细胞氧化应激损伤、增强细胞线粒体功能、促进细胞脂质代谢发挥对乙醇致L02损伤的治疗作用。

关键词： AdipoRon 肝细胞损伤线粒体功能脂质代谢

Ghrelin减轻高糖致肝细胞损伤的作用及机制研究

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Ghrelin减轻高糖致肝细胞损伤的作用及机制研究

作者：叶圣莹大理大学

学位级别：硕士

目的:通过观察细胞形态,检测细胞增殖能力,检测ROS、SOD、MDANLRP3、Caspase-1、IL-18和IL-1βm RNA表达水平,检测GSDMD蛋白表达量,探讨Ghrelin对高糖所致肝细胞损伤的保护作用和分子机制,为糖尿病性肝损伤的防治拓展思路。方法:采用AML... 详细信息

目的:通过观察细胞形态,检测细胞增殖能力,检测ROS、SOD、MDANLRP3、Caspase-1、IL-18和IL-1βm RNA表达水平,检测GSDMD蛋白表达量,探讨Ghrelin对高糖所致肝细胞损伤的保护作用和分子机制,为糖尿病性肝损伤的防治拓展思路。方法:采用AML-12细胞,建立高糖致肝细胞损伤的细胞模型,并给予Ghrelin(10mmol/L)进行干预。实验随机分为4组:空白对照组(Con),空白+Ghrelin组(G-Con),高糖组(HG),高糖+Ghrelin组(G-HG)。CCK8法检测细胞增殖能力;倒置显微镜观察各组细胞形态变化;imagej软件测量各组细胞直径和面积;检测各组丙氨酸氨基转移酶(ALT)含量;检测各组丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量;采用DCFH-DA试剂标记细胞内活性氧簇(ROS)法测定细胞内ROS含量;RT-q PCR检测各组NLRP3、Caspase-1、IL-18和IL-1βm RNA表达水平,免疫荧光检测GSDMD蛋白表达量。结果:与对照组比较,HG组随着葡萄糖浓度增加和培养时间的延长,细胞增殖能力不断下降(P肝细胞增殖能力下降最为显著,本研究以此浓度完成后续实验。给予Ghrelin干预,与对照组比较,HG各组细胞增殖能力随着时间延长呈不断下降趋势(P细胞增殖能力则明显升高(P细胞增大、胞膜边缘模糊、数量减少;经Ghrelin干预后,G-HG组细胞呈规则多边形、胞膜边缘清晰、数量增加。同时利用Imagej软件测量各组细胞直径及面积的变化,结果显示,HG组细胞平均直径及面积均明显高于对照组(P细胞平均直径及面积较HG组明显降低(P细胞ALT结果显示,与对照组比较,HG组ALT水平明显升高(P细胞中总ROS结果显示,与对照组比较,HG组ROS阳性细胞相对荧光强度上调3.42倍,结果具有显著差异(P细胞相对荧光强度下调3.05倍,结果具有显著差异(P肝细胞损伤,且Ghrelin减轻高糖所致肝细胞损伤作用机制可能是通过抑制氧化应激,影响NLRP3炎症小体表达,抑制NLRP3-Caspase-1介导的细胞焦亡经典途径实现的。

关键词： Ghrelin 高糖肝细胞损伤氧化应激细胞焦亡