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血管内皮细胞分泌的基质通过整合素α5β1调节肝实质细胞功能成熟的机制研究

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血管内皮细胞分泌的基质通过整合素α5β1调节肝实质细胞功能成熟...

作者：郭昕悦首都医科大学

学位级别：硕士

肝实质细胞的成熟分化与功能获得依赖其独特微环境中信号分子的精确调控。血管内皮细胞及其分泌的信号分子是肝脏微环境的重要组成部分。研究表明,血管内皮细胞分泌的细胞外基质对于内皮细胞成熟分化及血管再生与重构等功能具有重要作用... 详细信息

肝实质细胞的成熟分化与功能获得依赖其独特微环境中信号分子的精确调控。血管内皮细胞及其分泌的信号分子是肝脏微环境的重要组成部分。研究表明,血管内皮细胞分泌的细胞外基质对于内皮细胞成熟分化及血管再生与重构等功能具有重要作用,但其能否调节肝实质细胞的成熟分化与功能获得尚不清楚。本研究制备并鉴定人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分泌的基质（EC-matrix）,并探究其对于人脂肪干细胞分化的肝实质样细胞（hASC-HLCs）功能成熟的作用及机制,主要研究结果如下:1 EC-matrix的特征鉴定免疫荧光染色及扫描电镜观察证实,EC-matrix中包含纤粘连蛋白（FN）,I型胶原及IV型胶原;FN呈丰富的纤维状结构,IV型胶原呈网状纤维结构,I型胶原呈较致密的点状。原子力显微镜检测基质的表面钢度显示,HUVECs培养24小时分泌的基质（EC-matrix-24h）其杨氏模量为10.21kPa,而EC-matrix-48h、EC-matrix-72h及EC-matrix-96h的杨氏模量分别为7.96kPa、5.85kPa及8.02kPa。其中EC-matrix-72h的表面钢度与正常人肝脏组织相似。2 EC-matrix促进hASC-HLCs的代谢功能成熟实时定量RT-PCR分析显示,与对照组（即培养在I型胶原包被基质上的hASC-HLCs）相比,培养在EC-matrix上的hASC-HLCs中,药物代谢I相酶,包括CYP1A2,CYP2B6,CYP2C9,CYP2E1以及CYP3A4;II相酶,包括NAT2;和药物转运体,包括ABCC2,SLC22A5,DPP4,以及转录因子FOXA2,核受体HNF4α和PXR的表达均明显增高。免疫荧光染色显示,培养在EC-matrix上的hASC-HLCs中DPP4表达明显高于对照组。P450-Glo分析结果证实,培养在EC-matrix上的hASC-HLCs CYP2C9与CYP3A4酶活性明显高于对照组。免疫蛋白印迹（WB）结果显示,培养在EC-matrix上的hASC-HLCs中,FOXA2,HNF4α以及PXR的蛋白表达明显高于对照组。3敲减FN可减弱EC-matrix促进hASC-HLCs功能成熟的作用实时定量RT-PCR测定表明,EC-matrix-FN敲减组（即培养在EC-matrix-FN敲减基质上的hASC-HLCs）中,I相酶（CYP2B6,CYP2C9,CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1）和药物转运体（ABCC2和DPP4）的表达显著低于EC-matrix对照组（即培养在EC-matrix基质上的hASC-HLCs）;FOXA2,HNF4α和PXR的mRNA水平表达明显下降。免疫荧光染色分析显示,EC-matrix-FN敲减组中DPP4表达显著下降。P450-Glo分析表明,EC-matrix-FN敲减组中CYP2C9和CYP3A4酶活性也低于EC-matrix对照组。WB结果显示,EC-matrix-FN敲减组中FOXA2,HNF4α及PXR的蛋白水平明显低于EC-matrix对照组。4 EC-matrix促进hASC-HLCs中整合素α5的表达实时定量RT-PCR结果显示,培养在EC-matrix上的hASC-HLCs中,整合素亚基α5的表达与对照组（即培养在I型胶原包被基质上的hASC-HLCs）相比明显升高,而其它整合素亚基则无明显变化。免疫荧光染色及半定量分析表明,培养在EC-matrix上的hASC-HLCs中整合素α5β1的表达相比对照组有明显升高。流式细胞分析表明,培养在EC-matrix上的hASC-HLCs中整合素亚基α5以及整合素α5β1的表达与对照组相比明显增高,而整合素亚基β1则无明显差异。5敲减hASC-HLCs中整合素α5的表达减弱EC-matrix对肝实质细胞代谢功能成熟的作用实时定量RT-PCR分析表明,转染整合素α5 siRNA的hASC-HLCs中,I相酶（CYP2B6,CYP2C9和CYP3A4）,II相酶（NAT2）和药物转运体（ABCC2,SLC22A5和DPP4）的表达明显低于对照组（即转染Nontarget siRNA的hASC-HLCs）;FOXA2,HNF4α和PXR的mRNA表达水平明显下调。免疫荧光染色及半定量分析显示,转染整合素α5siRNA的hASC-HLCs中,DPP4表达明显下调。P450-Glo分析表明,转染整合素α5 siRNA的hASC-HLCs中,CYP2C9和CYP3A4活性明显低于对照组。WB结果表明,转染整合素α5siRNA的hASC-HLCs中,FOXA2,HNF4α和PXR的蛋白水平与对照组相比也有显著下调。6整合素α5β1通过Src磷酸化介导EC-matrix促进hASC-HLCs的代谢功能成熟在EC-matrix上培养的hASC-HLCs中分别加入整合素连接酶（ILK）抑制剂Cpd2

关键词：内皮细胞细胞外基质肝实质细胞代谢整合素 Src

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不同粘附剂对大鼠肝实质细胞体外培养的影响

现代生物医学进展 2021年第15期21卷 2808-2811页

作者：谷若曦杨珂张华伟张佳妮丁成成彭甜甜陈伟航程硕华茜北京中医药大学中医学院北京100029 北京中医药大学生命科学学院北京100029 北京中医药大学针灸推拿学院北京100029

目的:比较鼠尾胶与多聚赖氨酸对大鼠肝实质细胞体外培养的影响。方法:分别采用鼠尾胶与多聚赖氨酸包被同一块培养板,然后将从大鼠肝脏中分离出来的肝实质细胞,接种到包被好的培养板中。于接种前(0 h),接种后体外培养24 h、72 h显微镜下... 详细信息

目的:比较鼠尾胶与多聚赖氨酸对大鼠肝实质细胞体外培养的影响。方法:分别采用鼠尾胶与多聚赖氨酸包被同一块培养板,然后将从大鼠肝脏中分离出来的肝实质细胞,接种到包被好的培养板中。于接种前(0 h),接种后体外培养24 h、72 h显微镜下观察细胞贴壁与形态变化情况。结果:接种前(0 h)可见新鲜分离的肝实质细胞呈圆形,明亮,有立体感,轮廓完整,层次清楚;体外培养24 h后两种粘附剂包被的同一块培养板中,均可观察到肝实质细胞正常生长,且细胞形态由圆形转变为多角形,并且融合聚集,胞体变平整,贴壁情况区别不大;培养72 h后细胞间开始出现连接,大部分肝细胞呈现出双核或多核,并且多聚赖氨酸包被的培养板中可见大量肝细胞呈岛屿状,已完全贴壁于培养板上。结论:多聚赖氨酸作为包被材料更有利于肝实质细胞贴壁生长以及保持细胞固有形态。

关键词：肝实质细胞鼠尾胶多聚赖氨酸(PLL) 体外培养

胆酸修饰的联苯双酯脂质体体外肝实质细胞摄取特性

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中国药科大学学报 2010年第4期41卷 342-347页

作者：陈志鹏朱家壁陈洪轩肖衍宇陈军蔡宝昌南京中医药大学药剂学教研室南京210046 中国药科大学药学院南京210009 河南大学药学院开封475001

用胆酸修饰联苯双酯脂质体,以期通过受体配体特异性的结合,增加药物在肝实质细胞的蓄积。本研究采用薄膜超声法制备联苯双酯脂质体(LP-DDB)和胆酸修饰联苯双酯脂质体(BP2B-LP-DDB),采用葡聚糖凝胶法测定包封率,比较LP-DDB和BP2B-LP-DDB... 详细信息

用胆酸修饰联苯双酯脂质体,以期通过受体配体特异性的结合,增加药物在肝实质细胞的蓄积。本研究采用薄膜超声法制备联苯双酯脂质体(LP-DDB)和胆酸修饰联苯双酯脂质体(BP2B-LP-DDB),采用葡聚糖凝胶法测定包封率,比较LP-DDB和BP2B-LP-DDB的理化性质差异;分离培养肝实质细胞,研究孵化温度、给药剂量等对肝实质细胞体外摄取上述两种脂质体的影响。BP2B的修饰对脂质体的包封率、粒径、多分散指数和Zeta电位均无显著性影响。LP-DDB和BP2B-LP-DDB中药物平均包封率分别为(90.66±1.22)%和(86.89±1.61)%,平均粒径分别为(309.52±16.74)和(273.77±14.14)nm,Zeta电位分别为(24.98±2.03)和(22.21±7.03)mV。与LP-DDB相比,BP2B-LP-DDB与肝实质细胞的结合及摄取均显著增加,具有明显的主动转运特征。胆酸修饰的脂质体可作为肝实质细胞靶向的载体,可以通过受体介导的方式促进药物向肝实质细胞内的传递。

关键词：联苯双酯脂质体胆酸受体介导肝实质细胞

脂多糖诱导血管内皮细胞分泌的细胞外基质调节人肝实质细胞紧密连接蛋白表达的研究

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中国细胞生物学学报 2024年第5期 892-900页

作者：李卫红马悦佼贺旭王梓祎郭昕悦张海燕首都医科大学基础医学院基础医学国家级实验教学中心首都医科大学基础医学院细胞生物学系

该文分析脂多糖诱导人血管内皮细胞去分化促进细胞外基质分泌增加,调节人肝实质细胞紧密连接蛋白表达的作用。利用脂多糖诱导体外培养人脐静脉内皮细胞72 h后,分析内皮细胞特征以及分泌的细胞外基质成分表达及超微结构变化;将人肝实质... 详细信息

该文分析脂多糖诱导人血管内皮细胞去分化促进细胞外基质分泌增加,调节人肝实质细胞紧密连接蛋白表达的作用。利用脂多糖诱导体外培养人脐静脉内皮细胞72 h后,分析内皮细胞特征以及分泌的细胞外基质成分表达及超微结构变化;将人肝实质细胞接种于脂多糖或对照处理的内皮细胞分泌的基质上培养72 h后,分析肝实质细胞中紧密连接蛋白、整合素及DNA甲基化及羟甲基化的变化。结果表明,脂多糖诱导人脐带静脉内皮细胞去分化,以及分泌的细胞外基质成分组成及结构发生变化;脂多糖诱导内皮细胞分泌的基质下调人肝实质细胞中紧密连接蛋白Claudin 1和整合素α5蛋白及DNA羟甲基化的水平。研究表明,受损血管内皮细胞分泌的细胞外基质抑制人肝实质细胞紧密连接蛋白Claudin 1的表达。

关键词：血管内皮细胞细胞外基质去分化肝实质细胞紧密连接

BMP对小鼠肝干细胞定向分化为肝实质细胞的作用研究

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BMP对小鼠肝干细胞定向分化为肝实质细胞的作用研究

作者：陈聪重庆医科大学

学位级别：硕士

目的：以小鼠胚胎肝干细胞HP14.5为种子细胞，将已构建的表达骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins,BMPs）2-15、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)和绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein,GFP)的重组腺病毒，分别感染小鼠胚胎肝干细胞HP14.5，诱导其分化，探讨重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白2-15（rAdBMP2-15）对诱导小鼠胚胎肝干细胞HP14.5向肝实质细胞定向分化的作用，为肝干细胞移植在终末期肝病的临床应用打下理论和实验基础。方法： 1.采用rAdBMP2-15、rAdHGF和rAdGFP分别感染小鼠胚胎肝干细胞HP14.5，诱导其分化，在病毒感染后的第1、4、7天采用荧光素酶报告基因检测，从BMP家族成员中初步筛选出能有效诱导小鼠胚胎肝干细胞HP14.5向肝实质细胞分化的BMP因子;2.选择诱导作用较强的BMP家族成员BMP9,分为BMP9组、HGF阳性对照组和GFP阴性对照组，分别感染HP14.5细胞，在病毒感染后的第1、4、7和10天采用荧光素酶报告基因检测Alb-Gluc活性;然后在第7天通过RT-PCR、Real-Time PCR和细胞免疫荧光等方法，检测白蛋白(albumin，Alb)、甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）和细胞角蛋白18（cytokeratin18，CK18）等肝细胞相关标志物的表达情况;3.在第4、7、10天通过糖原合成染色(PAS)实验、尿素氮合成功能检测和吲哚菁绿(ICG)摄取功能试验，探讨BMP9诱导后HP14.5细胞的肝细胞功能状况。结果： 1.BMP2、BMP9和BMP10能有效诱导HP14.5细胞的Alb-Gluc活性增高，其中BMP9的作用最强。 2.荧光素酶报告基因Alb-Gluc表达活性检测，诱导1、4、7和10天的BMP9组、HGF阳性对照组实验细胞的Alb-Gluc表达活性随着诱导时间的延长逐渐增加，在第7天达到峰值，到第10天Alb-Gluc表达趋于稳定，较GFP阴性对照组明显升高（P细胞的Alb和CK18的mRNA表达明显高于GFP阴性对照组，而AFP的mRNA表达较GFP阴性对照组显著降低, Real-Time PCR进一步检测，重复三次实验结果与RT-PCR一致（P细胞免疫荧光染色，诱导7天后的实验细胞胞浆内表达肝细胞相关的Alb、CK18等蛋白，而GFP阴性对照组几乎无表达;5.PAS染色，BMP9组、HGF阳性对照组实验细胞胞浆内存在紫红色颗粒，呈阳性反应;且随着时间的延长明显加深，在第10天最明显，而GFP阴性对照组呈弱阳性或阴性;6.尿素合成功能检测，BMP9组、HGF阳性对照组实验细胞培养液中尿素氮读数逐日上升，而对照组无明显变化;7.ICG摄取实验，BMP9组、HGF阳性对照组实验细胞的ICG摄取量随着细胞诱导时间的延长而逐渐增加，在第10天细胞阳性率最高，其BMP9组和HGF阳性对照组的细胞阳性率分别为82%和80%左右，而GFP阴性对照组阳性率约为15%。结论：从BMP家族成员2-15中筛选出具有诱导小鼠胚胎肝干细胞向肝实质细胞方向分化的细胞因子BMP2、BMP9和BMP10;证实了BMP9具有一定的诱导HP14.5向成熟肝细胞样细胞分化的作用，分化后的细胞具有成熟肝细胞的合成代谢功能。

关键词：骨形态发生蛋白肝干细胞分化肝实质细胞

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脂质体肝实质细胞靶向性研究

药学学报 2003年第2期38卷 143-146页

作者：侯新朴王黎王向涛李沙北京大学药学院药剂系北京100083

目的　脂质体经配体修饰后介导受体细胞 ,以达靶向给药。方法　肝实质细胞上无唾液酸糖蛋白受体(ASGP R)的配体无唾液酸胎球蛋白 (AF)修饰脂质体得AF SSL。将ASGP R重组于脂质双分子膜 (BLM)得ASGP R BLM ,与AF SSL相互作用 ,监测BLM膜... 详细信息

目的　脂质体经配体修饰后介导受体细胞 ,以达靶向给药。方法　肝实质细胞上无唾液酸糖蛋白受体(ASGP R)的配体无唾液酸胎球蛋白 (AF)修饰脂质体得AF SSL。将ASGP R重组于脂质双分子膜 (BLM)得ASGP R BLM ,与AF SSL相互作用 ,监测BLM膜电参数变化 ,确定受体配体间识别反应 ;用3H标记方法测AF SSL与肝实质细胞在体内外靶向性 ;将AF SSL包抗癌药阿霉素 (ADM) ,考察其抗癌药效。结果　ASGP R BLM稳定时间随AF SSL加入量增加而缩短 ,表现出明显的量效关系 ,证明在ASGP R BLM与AF SSL之间有特异识别反应 ;体外AF SSL与肝实质细胞结合率明显高于无AF修饰脂质体SSL(在第 10和 90min时P 肝癌疗效 ,AF SSL组大鼠存活期显著长于无AF修饰组 ,且对心、肾、肺的毒副作用小。结论　配体修饰脂质体达到主动靶向对应受体细胞是可行的。

关键词：脂质体肝实质细胞靶向性研究抗癌药

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炎症体在肝实质细胞中的表达和活化研究

炎症体在肝实质细胞中的表达和活化研究

小蘖碱抑制游离脂肪酸诱导小鼠肝实质细胞脂肪变性

第八届全国免疫学学术大会

作者：刘钱黄广宇府伟灵倪兵吴玉章王靖雪重庆第三军医大学基础部免疫教研室重庆第三军医大学附属西南医院感染科重庆第三军医大学附属西南医院检验科

目的:通过对比炎症体(inflammasome)各组分在LO2正常肝细胞株、正常/慢性肝炎来源的肝穿组织中的活化情况,初步研究炎症体在肝实质细胞中的可能作用。方法:利用 RT-PCR对比检测LO2(非刺激/LPS刺激)和肝穿组织(正常/慢性肝炎)及正常人的P... 详细信息

目的:通过对比炎症体(inflammasome)各组分在LO2正常肝细胞株、正常/慢性肝炎来源的肝穿组织中的活化情况,初步研究炎症体在肝实质细胞中的可能作用。方法:利用 RT-PCR对比检测LO2(非刺激/LPS刺激)和肝穿组织(正常/慢性肝炎)及正常人的PBMC细胞中caspase-1、AIM2、IFI16等的表达变化;Western blot对比检测肝穿组织(正常/慢性肝炎)、LO2各刺激与非刺激状态下胞内caspase-1的活化情况;组织免疫组化对比检测肝穿组织(正常/慢性肝炎)石蜡切片中caspase-1、IL-1β的表达;ELISA对比检测慢性肝炎病人血清及LO2各刺激与非刺激IL-1β的分泌情况,并通过阻断剂Z-YVAD(OMe)-FMK特异性阻断LO2细胞株中caspase-1活化后,分析IL-1β分泌的变化情况。结果:RT-PCR和Western blot结果显示,在炎症环境中,LO2正常肝细胞株中caspase-1、AIM2、IFI16表达增高,慢性乙肝病人来源的肝组织较正常肝组织caspase-1、AIM2、IFI-16表达也有升高;炎症体的各组分的表达并非局限于枯否细胞和肝血窦内皮细胞,而是在肝实质细胞中也有大量表达;并且,Western blot结果显示炎症体在肝实质细胞中也能有效活化,并切割IL-1β,L-1β的分泌随炎症刺激增强而增强。结论:炎症体并非是单核吞噬细胞系统中独有的危险信号感受系统,它在肝实质细胞中也能表达并有效活化,提示传统的炎症体功能可能也是肝实质细胞来源的固有免疫防御机制的重要成分。

关键词：肝实质细胞慢性乙型肝炎炎症体和caspase-1 IL-1β

来源： cnki会议评论

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现代生物医学进展 2015年第1期15卷 14-17,32页

作者：赵娜徐会王赫王钧毅齐社宁杨俊涛兰州大学基础医学院甘肃兰州730030 蛋白质组学国家重点实验室北京蛋白质组研究中心国家蛋白质科学中心(北京) 军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京102206 蛋白质药物国家工程研究中心北京102206

目的:探讨小蘖碱(Berberine)对游离脂肪酸(free fatty acids,FFAs)诱导的小鼠肝实质细胞脂肪变性的影响。方法:胶原酶灌注分离BALB/c小鼠原代肝实质细胞并体外培养。分对照组,高脂组,高脂加小蘖碱处理组。体外测定细胞内甘油三酯的含量... 详细信息

目的:探讨小蘖碱(Berberine)对游离脂肪酸(free fatty acids,FFAs)诱导的小鼠肝实质细胞脂肪变性的影响。方法:胶原酶灌注分离BALB/c小鼠原代肝实质细胞并体外培养。分对照组,高脂组,高脂加小蘖碱处理组。体外测定细胞内甘油三酯的含量。利用油红染色观察细胞的脂肪样变性。通过Western印迹法检测肝实质细胞内MAPK相关信号通路磷酸化的变化。实时定量PCR检测肝实质细胞中与脂肪化密切相关的mi R-122的表达和相关靶基因的表达改变。结果:与高脂组比较,小蘖碱处理组肝实质细胞内甘油三酯含量降低,脂肪颗粒减少,脂肪变性明显改善,并具有明显的剂量效应,小蘖碱能够抑制FFAs诱导的JNK通路磷酸化。Q-PCR结果表明小蘖碱能够促进肝实质细胞内mi R-122的表达,并降低脂肪化相关基因Dgat2的表达。结论:小蘖碱能够显著改善高脂诱发的肝脂肪变性,抑制JNK通路磷酸化,其机制可能同mi R-122通路相关。

关键词：小蘖碱游离脂肪酸肝实质细胞脂肪变性