BMP对小鼠肝干细胞定向分化为肝实质细胞的作用研究

作     者：陈聪 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：康权

授予年度：2013年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100202[医学-儿科学] 10[医学] 

主      题：骨形态发生蛋白 肝干细胞 分化 肝实质细胞 

摘      要：目的：以小鼠胚胎肝干细胞HP14.5为种子细胞，将已构建的表达骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins,BMPs）2-15、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)和绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein,GFP)的重组腺病毒，分别感染小鼠胚胎肝干细胞HP14.5，诱导其分化，探讨重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白2-15（rAdBMP2-15）对诱导小鼠胚胎肝干细胞HP14.5向肝实质细胞定向分化的作用，为肝干细胞移植在终末期肝病的临床应用打下理论和实验基础。 方法： 1.采用rAdBMP2-15、rAdHGF和rAdGFP分别感染小鼠胚胎肝干细胞HP14.5，诱导其分化，在病毒感染后的第1、4、7天采用荧光素酶报告基因检测，从BMP家族成员中初步筛选出能有效诱导小鼠胚胎肝干细胞HP14.5向肝实质细胞分化的BMP因子;2.选择诱导作用较强的BMP家族成员BMP9,分为BMP9组、HGF阳性对照组和GFP阴性对照组，分别感染HP14.5细胞，在病毒感染后的第1、4、7和10天采用荧光素酶报告基因检测Alb-Gluc活性;然后在第7天通过RT-PCR、Real-Time PCR和细胞免疫荧光等方法，检测白蛋白(albumin，Alb)、甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）和细胞角蛋白18（cytokeratin18，CK18）等肝细胞相关标志物的表达情况;3.在第4、7、10天通过糖原合成染色(PAS)实验、尿素氮合成功能检测和吲哚菁绿(ICG)摄取功能试验，探讨BMP9诱导后HP14.5细胞的肝细胞功能状况。 结果： 1.BMP2、BMP9和BMP10能有效诱导HP14.5细胞的Alb-Gluc活性增高，其中BMP9的作用最强。 2.荧光素酶报告基因Alb-Gluc表达活性检测，诱导1、4、7和10天的BMP9组、HGF阳性对照组实验细胞的Alb-Gluc表达活性随着诱导时间的延长逐渐增加，在第7天达到峰值，到第10天Alb-Gluc表达趋于稳定，较GFP阴性对照组明显升高（P0.05）;3.RT-PCR检测，诱导7天后的BMP9组、HGF阳性对照组实验细胞的Alb和CK18的mRNA表达明显高于GFP阴性对照组，而AFP的mRNA表达较GFP阴性对照组显著降低, Real-Time PCR进一步检测，重复三次实验结果与RT-PCR一致（P0.05）;4.细胞免疫荧光染色，诱导7天后的实验细胞胞浆内表达肝细胞相关的Alb、CK18等蛋白，而GFP阴性对照组几乎无表达;5.PAS染色，BMP9组、HGF阳性对照组实验细胞胞浆内存在紫红色颗粒，呈阳性反应;且随着时间的延长明显加深，在第10天最明显，而GFP阴性对照组呈弱阳性或阴性;6.尿素合成功能检测，BMP9组、HGF阳性对照组实验细胞培养液中尿素氮读数逐日上升，而对照组无明显变化;7.ICG摄取实验，BMP9组、HGF阳性对照组实验细胞的ICG摄取量随着细胞诱导时间的延长而逐渐增加，在第10天细胞阳性率最高，其BMP9组和HGF阳性对照组的细胞阳性率分别为82%和80%左右，而GFP阴性对照组阳性率约为15%。 结论：从BMP家族成员2-15中筛选出具有诱导小鼠胚胎肝干细胞向肝实质细胞方向分化的细胞因子BMP2、BMP9和BMP10;证实了BMP9具有一定的诱导HP14.5向成熟肝细胞样细胞分化的作用，分化后的细胞具有成熟肝细胞的合成代谢功能。