检索结果-南通市图书馆

作者：郑书香浙江大学

学位级别：硕士

葡萄糖醛酸在医药和保健品等领域都有广泛的应用。但目前葡萄糖醛酸的工业生产主要是通过硝酸氧化法等化学合成手段,存在产品收率低、环境污染严重、成本高等问题。本文的主要目的是建立以生物法合成葡萄糖醛酸的新方法,探索更经济、有... 详细信息

葡萄糖醛酸在医药和保健品等领域都有广泛的应用。但目前葡萄糖醛酸的工业生产主要是通过硝酸氧化法等化学合成手段,存在产品收率低、环境污染严重、成本高等问题。本文的主要目的是建立以生物法合成葡萄糖醛酸的新方法,探索更经济、有效和环境友好的葡萄糖醛酸合成新途径。首先将全合成的肌醇氧化酶(MIOX)基因连接至(?)pET28a(+-)载体,构建表达载体pET28a(+)-MIOX,并以E. coli BL21(DE3)为宿主菌实现表达。对重组菌Ecoli BL21(DE3)/pET28a(+)-MIOX表达肌醇氧化酶的条件进行了优化,结果表明目标蛋白在对数生长期中期以0.1mM IPTG在26℃下诱导表达8h时,酶活最高可达45.4kU/L。由于融合表达的肌醇氧化酶带有His标签,开展了Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白的研究,实现了高回收率(63%)和高比活(610U/mg)产物。对纯化得到的肌醇氧化酶的酶学性质进行初步分析。结果表明纯化肌醇氧化酶催化反应的最适pH值为6.5,最适温度为30℃。然后开展利用重组菌体作为催化剂以肌醇为底物生产葡萄糖醛酸的研究。首先考察完整细胞和粗酶液对葡萄糖醛酸产量的影响,发现整细胞催化效率最高。其次,对整细胞催化反应条件进行优化,确定最佳反应条件：在5mL MOPS缓冲体系(pH7.5)中,初始菌体浓度为20g/L(DCW),肌醇浓度为2g/L,于30℃,100r/min条件下反应2h。在这一最优条件下,葡萄糖醛酸产量达2.13g/L,肌醇转化率近99%。最后,考察在反应过程中添加新鲜菌体对转化效率的影响,分别于反应2、4、6h时添加菌体,每次菌体添加量5g/L(DCW),随着菌体的添加,葡萄糖醛酸产量逐渐升高,当第三次添加菌体后,葡萄糖醛酸产量趋于最大值15.7g/L。

关键词：葡萄糖醛酸肌醇氧化酶 E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-MIOX 肌醇亲和层析

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双功能脱毒用酿酒酵母的构建

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中国农业科技导报 2024年第2期26卷 226-233页

作者：王懿珺黄火清苏小运中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室北京100193

饲料中真菌毒素污染普遍,已经成为目前阻碍畜禽健康养殖的一大重要因素。真菌毒素种类繁多,其中黄曲霉毒素,尤其是黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)影响范围广、危害大,开发新方法用于饲料真菌毒素的脱毒是目前的研究热点。本研究分离... 详细信息

饲料中真菌毒素污染普遍,已经成为目前阻碍畜禽健康养殖的一大重要因素。真菌毒素种类繁多,其中黄曲霉毒素,尤其是黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)影响范围广、危害大,开发新方法用于饲料真菌毒素的脱毒是目前的研究热点。本研究分离并比较了4株不同的酿酒酵母菌株对AFB1的吸附能力,发现较其他方式(加热和甘露聚糖酶处理)和菌株,经葡聚糖酶处理后的酿酒酵母***菌株对AFB1吸附率最高,可达53.3%±8.2%。随后,再以该菌株为宿主菌组成型表达来自于约氏黄杆菌的肌醇氧化酶基因FjMiox,经改造后工程菌可将1 g·L^(-1)的肌醇全细胞转化为0.273 g·L^(-1)的葡萄糖醛酸。在动物肝脏内,葡萄糖醛酸可经酶催化和真菌毒素结合增强其水溶性使其易于排除,因此可合成葡萄糖醛酸的工程化酿酒酵母结合了肠道内吸附脱毒和肝脏内结合解毒2种功能,为解决黄曲霉毒素在饲料中的污染提供了新的可能解决方案。

关键词：黄曲霉毒素酿酒酵母肌醇氧化酶葡萄糖醛酸毒素脱毒

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生物催化肌醇生产葡萄糖醛酸转化体系的构建与优化

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山东化工 2024年第13期53卷 80-84页

作者：余展旺冯丽雄董启圣周理华叶春江深圳城市职业学院应用生物学院广东深圳518116 济南大学生物科学与技术学院山东济南250022

葡萄糖醛酸(D-glucuronic Acid),由于其良好的解毒性能,广泛应用于医药、保健、食品及医美领域。随着合成生物学的高速发展,利用工程菌生产葡醛酸的生物发酵法取代化学合成成为一种趋势。研究结果表明:最佳诱导条件为在OD_(600)为0.5时... 详细信息

葡萄糖醛酸(D-glucuronic Acid),由于其良好的解毒性能,广泛应用于医药、保健、食品及医美领域。随着合成生物学的高速发展,利用工程菌生产葡醛酸的生物发酵法取代化学合成成为一种趋势。研究结果表明:最佳诱导条件为在OD_(600)为0.5时,培养基中加入0.2 mmol/L的IPTG,26℃诱导8 h,构建的重组菌株BL21/pETDuet-miox可以实现肌醇氧化酶(MIOX)的高效表达;然后将肌醇氧化酶载体质粒pETDuet-miox转化进不同的表达宿主中,根据转化产量最佳表达宿主为Escherichia coli Rosetta(DE3);以肌醇氧化酶作为催化剂催化肌醇生产葡萄糖醛酸的最佳催化形式为冷冻破壁后菌体;得出最佳催化条件为在pH值为7.5的MOPS缓冲体系中,催化温度30℃时,对菌体添加量选择100 g/L湿菌体,底物质量浓度选定2 g/L。在此条件下肌醇转化率80.3%,葡醛酸产量达到1.606 g/L。本项研究为葡萄糖醛酸生物合成提供新的方法,也为葡醛酸的低成本工业化生产奠定基础。

关键词：大肠杆菌葡萄糖醛酸肌醇氧化酶生物转化

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重组大肠杆菌高效催化肌醇合成葡萄糖醛酸的研究

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药物生物技术 2013年第6期20卷 496-499页

作者：郑书香黄磊蔡谨徐志南浙江大学化学工程与生物工程学系浙江杭州310027

葡萄糖醛酸在医药和保健品等领域都有广泛的应用。该研究利用重组大肠杆菌(*** BL21(DE3)/pET28a(+)-MIOX)催化肌醇生成葡萄糖醛酸。首先对重组大肠杆菌培养条件进行优化以达到肌醇氧化酶高效表达的目标,以MBL作为发酵培养基,在对数生... 详细信息

葡萄糖醛酸在医药和保健品等领域都有广泛的应用。该研究利用重组大肠杆菌(*** BL21(DE3)/pET28a(+)-MIOX)催化肌醇生成葡萄糖醛酸。首先对重组大肠杆菌培养条件进行优化以达到肌醇氧化酶高效表达的目标,以MBL作为发酵培养基,在对数生长期中期(OD600=5.5)加入0.1 mmol/L IPTG,27℃下诱导6 h,肌醇氧化酶的酶活达到100.5 kU/L。然后利用重组菌菌体作为催化剂转化肌醇生产葡萄糖醛酸,以2 g/L肌醇为底物,30℃下反应2 h,葡萄糖醛酸的产量达到1.7g/L,肌醇的转化率为84%。在此基础上,进一步考察了多次添加新鲜菌体对葡萄糖醛酸合成的影响,当肌醇浓度为50 g/L时,经过3次添加菌体葡萄糖醛酸的最终产量达到15.7 g/L。该研究为生物法生产葡萄糖醛酸打下了坚实的基础。

关键词：肌醇氧化酶葡萄糖醛酸肌醇重组表达酶活大肠杆菌

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葡萄糖二酸（GA）生物传感器的作用机制及其在高产GA工程菌株筛选中的应用研究

葡萄糖二酸（GA）生物传感器的作用机制及其在高产GA工程菌株筛选...

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作者：郑爽山东大学

学位级别：硕士

葡萄糖二酸（glucaric acid,GA）是一种重要的多功能有机酸,在食品、医药及化工等领域应用广泛。现阶段,葡萄糖二酸的生产仍以化学氧化法生产为主,在高温高压的反应条件,由金属催化剂催化氧化纤维二糖或淀粉等而得,反应条件剧烈,选择性... 详细信息

葡萄糖二酸（glucaric acid,GA）是一种重要的多功能有机酸,在食品、医药及化工等领域应用广泛。现阶段,葡萄糖二酸的生产仍以化学氧化法生产为主,在高温高压的反应条件,由金属催化剂催化氧化纤维二糖或淀粉等而得,反应条件剧烈,选择性差,同时产生毒性副产物污染环境,种种不利因素使其受到限制,继而限制了 GA的生产和多功能的发挥。随着合成生物学的发展,将工程细胞作为微型工厂,利用人工组装和优化的代谢路径,合成高价值的目标产物成为未来“绿色制造”的有效途径和必然选择。美国麻省理工学院Prather团队在大肠杆菌中构建了葡萄糖二酸合成途径,并通过一系列改进,提高了葡萄糖二酸的产量。在对该微生物合成GA合成路径的研究中,研究人员发现肌醇氧化酶（myo-inositol oxygenase,MIOX）为合成路径的限速酶;而且,由于大肠杆菌耐酸能力的限制,产量无法超过5 g/L,更换宿主为酿酒酵母或其他菌种成为优于大肠杆菌的选择。然而,有效的高通量筛选方法的缺乏业已成为制约工程菌株高产GA研究中的问题之一。近年来,George ***团队在大肠杆菌中构建了一系列根据目标产物浓度产生不同荧光强度的生物传感器,其中包括针对GA的基于CdaR蛋白和一个521 bp核酸序列的启动子的生物感应器。但该GA生物感应器的作用机制并不清晰,且其组成元件均来自于大肠杆菌,在其他物种细胞中的使用受到限制。针对以上问题,本课题进行了如下研究:（1）初步确定转录激活因子CdaR蛋白与启动子序列结合区域随GA浓度变化而发生改变,进而影响启动子下游报告基因转录的作用机制。首先通过DNAaseI足迹实验,分别确定了不同GA浓度条件下,CdaR蛋白所结合的DNA区域的序列,证明CdaR蛋白所结合DNA序列受GA的浓度调节而发生变化;然后基于GA浓度与绿色荧光蛋白报告基因（gfp）转录水平的正相关性,确定了启动序列中的关键核酸序列;通过分析一系列氨基酸突变后的转录激活因子CdaR在GFP表达调控中的有效性,预测并验证了 CdaR与核酸序列结合的螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix,HTH）结构。本部分研究初步确定了大肠杆菌GA生物传感器的作用机制,为进一步优化GA生物感应器在大肠杆菌体系中的使用奠定了基础,并使该GA生物感应器向酵母等系统中的转化成为可能。（2）基于GA大肠杆菌生物感应系统,创建了一锅双菌法,并分别验证了该方法在大肠杆菌和酿酒酵母体系中高通量筛选高产GA工程菌株的有效性。所谓的一锅双菌法,是将生物感应系统的两个组成部分代谢产物合成路径和代谢产物传感器分置于两个菌体内。本研究证明,该方法相对于将生物感应系统置于同一菌体内的一锅单菌法有着更高的重复性和灵敏度,且由于GA生物感应器质粒pJKR-H-cdaR仅能在大肠杆菌系统中使用,所以经实验验证过的同样适用于酿酒酵母系统的一锅双菌法也有着比一锅单菌法更广的应用范围。（3）使用一锅双菌法自鼠源MIOX随机突变文库筛选获得3个GA产量明显提高的突变体,确定了 MIOX发生了突变的活性相关氨基酸位点,然后,通过测定各单位点突变的MIOX的体外活性,确定了增大MIOX活性的两氨基酸位点D82Y和S173N,分别提高了体外GA合成能力至原来的4倍和2.5倍,将D82Y和S173N两增强MIOX活性的位点进行组合,经测定GA产量为突变前的4倍。由于MIOX是GA合成途径中的限速步骤,该研究结果为GA产量的进一步提高奠定了基础。（4）以酿酒酵母为宿主,在肌醇氧化酶MIOX和葡萄糖醛酸脱氢酶（uronate dehydrogenase,Udh）组成的GA合成路径的基础上,通过增加1-磷酸肌醇合成酶（myo-inositol-l-phosphate synthase,INO1）和带有不同类型启动子的 NADH氧化酶（NADH oxidase,NOX）,构建了一系列含有不同GA合成途经的酿酒酵母工程菌株,并使用一锅双菌法测定各菌株的GA生产能力,确定了产量明显提高的GA合成路径。其中,INO1的引入增加了利用葡萄糖合成肌醇的途径从而增加了合成GA的底物,不同启动子下的NOX的引入缓解了菌体的代谢负担,受NADH诱导型启动子控制表达的NOX对产量的提高更有帮助,两者分别提高了 GA产量约58%和19%。

关键词：葡萄糖二酸生物传感器转录调控定向进化肌醇氧化酶大肠杆菌酿酒酵母氧化还原平衡

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葡萄糖醛酸生物转化体系的构建与优化研究

葡萄糖醛酸生物转化体系的构建与优化研究

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作者：董启圣济南大学

学位级别：硕士

葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid),简称葡醛酸,是一种非常有前景的化合物,由于其良好的解毒特性,目前广泛应用于医药,保健食品及化妆品等领域。目前葡萄糖醛酸的主要制备方法是浓硝酸氧化淀粉法,存在反应条件较为剧烈,底物选择性差,副产物... 详细信息

葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid),简称葡醛酸,是一种非常有前景的化合物,由于其良好的解毒特性,目前广泛应用于医药,保健食品及化妆品等领域。目前葡萄糖醛酸的主要制备方法是浓硝酸氧化淀粉法,存在反应条件较为剧烈,底物选择性差,副产物多,环境污染严重,能耗高,收率低等问题。近年来,随着环保方面的要求,生物法取代化学合成成为一种趋势,本论文旨在构建一种葡萄糖醛酸生物转化体系,并对其进行优化,建立一种环境友好,成本经济,反应条件温和的方法。主要研究内容如下:一、葡萄糖醛酸工程菌的构建与表达。构建重组质粒p ETDuet-miox,并将重组质粒转入BL21,构建重组菌株BL21/p ETDuet-miox。通过酶切实验,验证质粒构建成功,对重组菌株进行诱导表达,电泳结果显示目的蛋白表达,并对肌醇氧化酶的最佳诱导表达条件进行优化,结果得到最佳诱导条件为在OD为0.5时,加入0.2 m M的IPTG,26℃诱导8h。二、生物催化肌醇生产葡萄糖醛酸转化体系的建立。将肌醇氧化酶载体质粒p ETDuet-miox转化进不同的表达宿主中,根据转化产量确定最佳表达宿主为*** Rosetta(DE3)。由于实验室摇瓶发酵发酵液成分复杂,目的产物浓度低且液相测定发酵液有较多杂峰影响产物准确测定。因此采用以肌醇氧化酶作为催化剂的生物催化体系,并探究了肌醇氧化酶催化肌醇生产葡萄糖醛酸的最佳催化形式为冷冻破壁后菌体,且对催化反应体系优化后,得出最佳催化条件为在p H为7.5的MOPS缓冲体系中,催化温度30℃,菌体添加100 g/L湿菌体,底物浓度2 g/L。在此条件下肌醇转化率80.3%,葡萄糖醛酸产量达到1.606 g/L。三、探究透明颤菌血红蛋白对葡萄糖醛酸转化体系的影响及产量优化。构建重组菌Rosetta/p ETDuet-miox-vgb。探究透明颤菌血红蛋白对大肠杆菌生长状况的影响,菌株Rosette/p ETDuet-miox-vgb相比菌株Rosette/p ETDuet-miox,无论高溶氧还是低溶氧状况下菌体生长状况都都得到一定提升,高溶氧转速下(250 r/min)菌体密度提升5.08%,低溶氧转速下(150 r/min)菌体密度提升12.37%。证明VHb在低溶氧状态下能明显促进菌体生长。通过两菌株的粗酶活测定实验,Rosette/p ETDuet-miox-vgb组粗酶活达到65.13 k U/L,相比Rosette/p ETDuet-miox提升了62.61%,表明VHb能够明显提升肌醇氧化酶酶活。引入VHb后,对催化转化体系进行优化,最佳催化体系底物浓度为4 g/L,葡萄糖醛酸产量达到3.672 g/L,转化率达到90.68%。微量添加甲苯对肌醇转化率提升不明显,并在后续的间歇性添加菌体实验中获得17.87 g/L的葡萄糖醛酸产量。本课题成功构建了葡萄糖醛酸生物转化体系,不仅为葡萄糖醛酸生物合成提供新的方法,更为葡萄糖醛酸的低成本工业化生产奠定了理论基础,同时也为其它高附加值化学品的生物合成途径提供可借鉴经验。

关键词：大肠杆菌葡萄糖醛酸肌醇氧化酶透明颤菌血红蛋白生物转化

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