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卵形鲳鲹肌肉细胞系的建立与应用

卵形鲳鲹肌肉细胞系的建立与应用

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作者：张路珂中国农业科学院

学位级别：硕士

卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus),属鲈形目(Perciformes)、鲹科(Carangidae)、鲳鲹属(Trachinotus),俗称金鲳、黄腊鲳,广泛分布于中国、澳大利亚和日本的温热带海域。卵形鲳鲹以其生长速度快、食性简单、肉质鲜美、容易饲养等优点,成为我... 详细信息

卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus),属鲈形目(Perciformes)、鲹科(Carangidae)、鲳鲹属(Trachinotus),俗称金鲳、黄腊鲳,广泛分布于中国、澳大利亚和日本的温热带海域。卵形鲳鲹以其生长速度快、食性简单、肉质鲜美、容易饲养等优点,成为我国华南沿海地区重要的海水养殖鱼类之一。近年来,卵形鲳鲹养殖业发展迅速,然而随着养殖产业集约化程度的扩大和养殖密度的增加,由寄生虫、细菌和病毒引起的传染病频繁发生,造成严重的经济损失并制约卵形鲳鲹养殖业的发展。鱼类细胞系作为一种体外培养系统,因其具有成本低、试验重复性好、条件可精确控制的优点而成为该鱼种相关研究的重要工具。(1)本研究通过组织块贴壁法,以卵形鲳鲹肌肉组织为材料,建立了卵形鲳鲹肌肉细胞系(Golden pompano muscle cell line,GPM)。形态学观察结果显示GPM细胞在光学显微镜下呈纤维状,目前已连续稳定传至80余代。对GPM细胞的最适生长条件探究表明,GPM细胞的最适宜生长条件为:血清含量为20%,培养基类型为L-15。将扩增的COI(Cytochrome oxidase subunit I)基因片段和NCBI上已公布的卵形鲳鲹COI基因序列进行比对,结果显示两者的同源性为100%,证实GPM细胞来源于卵形鲳鲹。经核型分析实验发现,GPM细胞有非整倍体染色体数目出现,但依然保存了48条特征性染色体组型数。(2)通过脂质体转染技术,增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因成功在GPM细胞系中表达,转染效率约为60%,表明GPM细胞具有表达外源基因的能力,可用于体外基因功能研究。病毒敏感性实验显示GPM细胞对赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)敏感。此外,为评估宿主对RGNNV感染的免疫应答,检测了GPM细胞中6个免疫相关基因的转录水平。检测结果显示:6个基因在感染细胞中的表达水平均显著高于对照组(P细胞系可作为理想的体外研究工具,用于开展基因功能、病毒学、免疫学等其他相关学科的后续研究工作,同时也为其他鱼类细胞系的构建提供重要参考。(3)通过高浓度葡萄糖诱导卵形鲳鲹肌肉细胞凋亡、氧化应激和内质网应激(ERS)模型,探讨牛磺酸对高糖引起细胞不利表现的影响及作用机制。结果表明:牛磺酸能显著缓解高糖诱导的ADP/ATP比值和活性氧(ROS)水平的升高以及线粒体膜电位(MMP)的降低。对于线粒体相关基因,HG组OPA1和MFN2的m RNA水平显著降低,而HG+T组和对照组之间没有发现差异。高糖诱导细胞色素C(Cyt C)释放和细胞凋亡,牛磺酸可抑制细胞凋亡。高糖还通过增加葡萄糖摄取能力和影响糖原合成酶和糖原磷酸化酶的m RNA表达,导致细胞糖原累积,补充牛磺酸后有效缓解。采用尼罗红染色观察GPM细胞内脂质沉积情况,RT-q PCR检测内质网应激和脂代谢相关基因m RNA表达水平,结果显示ERS在GPM细胞脂质沉积过程被激活,HG+T组能够显著缓解高糖引起的脂质沉积。综上所述,牛磺酸有效缓解了GPM细胞中由高糖诱导的ERS、糖原累积、细胞凋亡和线粒体氧化应激。ROS的产生、GRP78/PERK、AMPK/PGC-1α信号通路和线粒体功能是牛磺酸在高糖条件下生物学效应的主要靶点。

关键词：卵形鲳鲹肌肉细胞系高糖牛磺酸氧化应激

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青鱼nanog和oct4基因的鉴定及青鳉肌肉细胞系的建立

青鱼nanog和oct4基因的鉴定及青鳉肌肉细胞系的建立

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作者：邓羽华中农业大学

学位级别：硕士

作为“四大家鱼”之首,青鱼(Mylopharyngodon piceus)是我国主要的养殖品种之一,具有重要的经济价值和科研意义。目前,有关青鱼的研究主要集中在人工养殖、营养与饲料和疾病防控等方向而缺乏分子水平上的一些基础研究数据。诱导多功能... 详细信息

作为“四大家鱼”之首,青鱼(Mylopharyngodon piceus)是我国主要的养殖品种之一,具有重要的经济价值和科研意义。目前,有关青鱼的研究主要集中在人工养殖、营养与饲料和疾病防控等方向而缺乏分子水平上的一些基础研究数据。诱导多功能干细胞(iPS)是一类具有无限自我更新能力且能在特定条件下定向分化的细胞,Nanog和Oct4基因是哺乳动物中维持胚胎干细胞多能性以及自我更新能力的关键性基因,也是成功诱导多功能干细胞的关键因子。为了成功诱导鱼类iPS,本研究分离和鉴定了青鱼nanog和oct4基因及nanog上游启动子序列,初步分析了它们的基因结构、在不同成体组织和早期胚胎发育中的表达模式,证明了它们的表达模式有别于哺乳动物,具有母源性表达特征。此外,本研究还建立了青鳉肌肉细胞系(OLM),分析和鉴定了它的基本生物学特征,并且通过荧光素酶实验测定了不同区段nanog启动子在OLM中的活性。其主要研究结果如下:1)Mpnanog基因组DNA(genomic DNA,gDNA)全长3295 bp,cDNA全长1550 bp,包括4个外显子,预计编码具有390个氨基酸残基的蛋白;多物种蛋白序列比对结果显示MpNanog具有一个Nanog蛋白保守的含有63个氨基酸残基的同源结构域,其中,MpNanog与团头鲂Nanog蛋白相似程度最高,可达到95%;进化树结果显示MpNanog与硬骨鱼类聚为同一分支。2)RT-PCR结果显示Mpnanog特异性表达于卵巢中以及早期胚胎发育过程,从未受精卵到囊胚期一直持续高表达,原肠胚期表达迅速下降;切片原位杂交结果进一步显示Mpnanog的转录本表达于卵子发育过程中的卵原细胞(I期)和初级卵母细胞(II期);同时,整胚原位杂交结果显示Mpnanog转录本的信号均匀的分布在早期胚胎发育的卵裂球中。3)通过TAIL-PCR技术克隆得到了长约1.8 kb的Mpnanog上游5’转录调控序列,构建了Mpnanog不同区段启动子的双色荧光质粒psi-CHECK-2-Mpnanog-1775、1070、550,并检测了它在2种转基因青鳉肌肉细胞系中均具有较高的活性。4)Mpoct4 cDNA全长共3412 bp,预测编码472个氨基酸;多物种蛋白序列比对显示MpOct4同样具有OCT4蛋白保守的POU和POU亚结构域,与已报道的团头鲂Oct4相似度最高,约为98.31%;进化树结果显示MpOct4与硬骨鱼类聚为同一分支。5)RT-PCR结果显示Mpoct4特异性表达于卵巢中以及早期胚胎发育过程,从未受精卵到原肠胚期一直持续高表达,胚胎后期表达量锐减;切片原位杂交结果进一步显示Mpoct4转录本表达于卵子发育过程中的卵原细胞(I期)和初级卵母细胞(II期);同时,整胚原位杂交结果显示Mpoct4转录本的信号分布于早期胚胎发育的卵裂球中。6)建立了青鳉肌肉细胞系,并对其冻存复苏能力、生长曲线、细胞来源和染色体核型等基本生物学特性进行了描述,然后对该细胞的脂质体转染效率进行了测定。一系列结果显示,OLM细胞系确实来源于青鳉,染色体众数为48,生长曲线呈“S”型以及该细胞系的转染效率约为40%。综上所述,我们首先分离和鉴定了青鱼中与哺乳动物干细胞主控基因Nanog和oct4同源的Mpnanog和Mpoct4基因,证明了它们的母源性表达特征;同时建立了1种能高效转染的青鳉肌肉细胞系,并且测试了Mpnanog启动子在其中的活性,为接下来鱼类iPS的研究奠定基础。

关键词：青鱼 nanog 启动子 oct4 青鳉肌肉细胞系

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