卵形鲳鲹肌肉细胞系的建立与应用

作     者：张路珂 

作者单位：中国农业科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：张殿昌

授予年度：2023年

学科分类：0908[农学-水产] 09[农学] 

主      题：卵形鲳鲹 肌肉细胞系 高糖 牛磺酸 氧化应激 

摘      要：卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus),属鲈形目(Perciformes)、鲹科(Carangidae)、鲳鲹属(Trachinotus),俗称金鲳、黄腊鲳,广泛分布于中国、澳大利亚和日本的温热带海域。卵形鲳鲹以其生长速度快、食性简单、肉质鲜美、容易饲养等优点,成为我国华南沿海地区重要的海水养殖鱼类之一。近年来,卵形鲳鲹养殖业发展迅速,然而随着养殖产业集约化程度的扩大和养殖密度的增加,由寄生虫、细菌和病毒引起的传染病频繁发生,造成严重的经济损失并制约卵形鲳鲹养殖业的发展。鱼类细胞系作为一种体外培养系统,因其具有成本低、试验重复性好、条件可精确控制的优点而成为该鱼种相关研究的重要工具。(1)本研究通过组织块贴壁法,以卵形鲳鲹肌肉组织为材料,建立了卵形鲳鲹肌肉细胞系(Golden pompano muscle cell line,GPM)。形态学观察结果显示GPM细胞在光学显微镜下呈纤维状,目前已连续稳定传至80余代。对GPM细胞的最适生长条件探究表明,GPM细胞的最适宜生长条件为:血清含量为20%,培养基类型为L-15。将扩增的COI(Cytochrome oxidase subunit I)基因片段和NCBI上已公布的卵形鲳鲹COI基因序列进行比对,结果显示两者的同源性为100%,证实GPM细胞来源于卵形鲳鲹。经核型分析实验发现,GPM细胞有非整倍体染色体数目出现,但依然保存了48条特征性染色体组型数。(2)通过脂质体转染技术,增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因成功在GPM细胞系中表达,转染效率约为60%,表明GPM细胞具有表达外源基因的能力,可用于体外基因功能研究。病毒敏感性实验显示GPM细胞对赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)敏感。此外,为评估宿主对RGNNV感染的免疫应答,检测了GPM细胞中6个免疫相关基因的转录水平。检测结果显示:6个基因在感染细胞中的表达水平均显著高于对照组(P0.05),提示宿主的干扰素和促炎因子免疫反应参与了RGNNV感染。综上所述,本研究开发并表征的GPM细胞系可作为理想的体外研究工具,用于开展基因功能、病毒学、免疫学等其他相关学科的后续研究工作,同时也为其他鱼类细胞系的构建提供重要参考。(3)通过高浓度葡萄糖诱导卵形鲳鲹肌肉细胞凋亡、氧化应激和内质网应激(ERS)模型,探讨牛磺酸对高糖引起细胞不利表现的影响及作用机制。结果表明:牛磺酸能显著缓解高糖诱导的ADP/ATP比值和活性氧(ROS)水平的升高以及线粒体膜电位(MMP)的降低。对于线粒体相关基因,HG组OPA1和MFN2的m RNA水平显著降低,而HG+T组和对照组之间没有发现差异。高糖诱导细胞色素C(Cyt C)释放和细胞凋亡,牛磺酸可抑制细胞凋亡。高糖还通过增加葡萄糖摄取能力和影响糖原合成酶和糖原磷酸化酶的m RNA表达,导致细胞糖原累积,补充牛磺酸后有效缓解。采用尼罗红染色观察GPM细胞内脂质沉积情况,RT-q PCR检测内质网应激和脂代谢相关基因m RNA表达水平,结果显示ERS在GPM细胞脂质沉积过程被激活,HG+T组能够显著缓解高糖引起的脂质沉积。综上所述,牛磺酸有效缓解了GPM细胞中由高糖诱导的ERS、糖原累积、细胞凋亡和线粒体氧化应激。ROS的产生、GRP78/PERK、AMPK/PGC-1α信号通路和线粒体功能是牛磺酸在高糖条件下生物学效应的主要靶点。