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产聚-β-羟基丁酸菌株筛选及发酵和提取工艺研究

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产聚-β-羟基丁酸菌株筛选及发酵和提取工艺研究

作者：董夏梦浙江师范大学

学位级别：硕士

聚-β-羟基丁酸(Poly-P-hydroxybutyrate, PHB)是微生物在碳、氮等营养失衡的条件下合成的碳源与能源的高分子储存物(分子量50000-1000000)。作为微生物合成的可降解材料,PHB除了具有与化学合成高分子相似的理化性质,还具有一般化学合... 详细信息

聚-β-羟基丁酸(Poly-P-hydroxybutyrate, PHB)是微生物在碳、氮等营养失衡的条件下合成的碳源与能源的高分子储存物(分子量50000-1000000)。作为微生物合成的可降解材料,PHB除了具有与化学合成高分子相似的理化性质,还具有一般化学合成高分子所没有的性质如光学活性、低透氧性、抗紫外辐射、生物可降解性、生物相容性、压电性和抗凝血性等,在工业、农业、环保、食品、医药等领域具有十分广阔的应用前景。如在医疗领域,PHB可以作为药物基质植入人体,以控制药物的释放,且最终降解产物为p-羟基丁酸,没有任何毒副作用。本文从自然环境分离得到一株较高产PHB苏云金芽孢杆菌菌株PX-95,通过培养基组分、培养条件优化提高PHB产量;通过提取条件优化提高PHB的提取效率,从而最大化PHB产量;最后实验中的提取物纯化分析,判断其结构、纯度等。首先,从浙江省各地(杭州、温州、宁波、金华、绍兴、丽水、台州)采集的土壤(主要来源有玉米地、番薯地、花生地等),分离筛选芽孢杆菌菌株188株。通过对PHB的定性和定量筛选等手段获得较高产PHB菌株,同时进行连续传代培养以获得PHB产量及遗传性状稳定的目的菌株。其次,单因素法优化培养基组分及培养条件。利用响应面法研究对PHB产量影响较大的5个因素(初始pH、培养温度、蔗糖浓度、蛋白胨浓度、总磷浓度)之间的交互关系以及最佳值。利用响应面法建立回归方程。通过计算获得最优发酵条件为：初始pH为7.44,培养温度为30.15℃,蔗糖浓度为51.31g/L,蛋白胨浓度为21.06g/L,总磷浓度为0.13g/L。经单因素及响应面优化后PX-95的PHB产量为8.934g/L,为筛选时PHB产量(0.136g/L)的66倍。然后,为了尽可能的使PHB产量最大化,还对提取工艺进行了初步研究。主要从单因素实验的基础上再进行响应面优化提取条件。从单因素实验得出提取温度、提取时间和提取物料比对PHB提取率影响较大。通过响应面法优化PHB提取条件,得到一个二次多项式回归模型(R2=0.9957),模型失拟项不显著(P=0.141>0.05),拟合度良好,这说明采用响应面法得到的工艺参数较为可信。最终结果表明PHB的最佳提取条件：提取温度为60.4℃、提取时间为2.2h和提取物料比为40.5mL/g,此时PHB提取率达87.31%。最后,将实验提取获得的粉末状或薄膜状固体采用紫外吸收光谱(UV)、核磁共振(NMR)等手段进行了分析,并与标准品进行比较。紫外吸收光谱中无杂质峰并且与PHB标准品的吸收峰一致,初步确定该提取物为PHB类似物,在浓硫酸降解过程中出现巴豆酸;核磁共振中的氢谱和碳谱分析可知,该提取物的结构为—[—O-CH(CH3)—CH2—CO—]—n。综合结果表明,从苏云金芽孢杆菌内提取获得的物质为聚-β-羟基丁酸(PHB)并且纯度接近100%。

关键词：苏云金芽孢杆菌聚-β-羟基丁酸发酵提取响应面法

1株产聚-β-羟基丁酸芽胞杆菌的分离、筛选与鉴定

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微生物学杂志 2011年第4期31卷 80-84页

作者：董夏梦宋迤明蒋冬花蓝丽精蔡琪敏浙江师范大学化学与生命科学学院浙江金华321004

从浙江省金华市花生地土样中筛选、分离纯化得到1株产聚-β-羟基丁酸编号为PX-95的芽胞杆菌,PHB产量为135.81 mg/L。根据形态特征、生理生化特征初步鉴定为芽胞杆菌属蜡样芽胞杆菌群,16S rDNA序列分析显示PX-95菌株与苏云金芽胞杆菌以... 详细信息

从浙江省金华市花生地土样中筛选、分离纯化得到1株产聚-β-羟基丁酸编号为PX-95的芽胞杆菌,PHB产量为135.81 mg/L。根据形态特征、生理生化特征初步鉴定为芽胞杆菌属蜡样芽胞杆菌群,16S rDNA序列分析显示PX-95菌株与苏云金芽胞杆菌以及蜡样芽胞杆菌均具有高度同源性,最后采用扩增gyrB(DNA促旋酶B亚单位)基因的方法将其鉴定为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)。

关键词：聚-β-羟基丁酸苏云金芽胞杆菌筛选鉴定

高产聚-β-羟基丁酸菌株筛选及发酵提取工艺研究

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高产聚-β-羟基丁酸菌株筛选及发酵提取工艺研究

作者：周琴浙江师范大学

学位级别：硕士

聚-β-羟基丁酸（Poly-β-hydroxybutyrate, PHB）是微生物在碳、氮等营养失衡的条件下合成的碳源与能源的高分子储存物（分子量50000-1000000）。作为微生物合成的可降解材料,PHB除了具有与化学合成高分子相似的理化性质,还具有一般化... 详细信息

聚-β-羟基丁酸（Poly-β-hydroxybutyrate, PHB）是微生物在碳、氮等营养失衡的条件下合成的碳源与能源的高分子储存物（分子量50000-1000000）。作为微生物合成的可降解材料,PHB除了具有与化学合成高分子相似的理化性质,还具有一般化学合成高分子所没有的性质如光学活性、低透氧性、抗紫外辐射、生物可降解性、生物相容性、压电性和抗凝血性等,在工业、农业、环保、食品、医药等领域具有十分广阔的应用前景。如在医疗领域,PHB可以作为药物基质植入人体,以控制药物的释放,且最终降解产物为B-羟基丁酸,对人体没有任何毒副作用。本文从自然环境分离得到—株较高产PHB巨大芽孢杆菌菌株Bm-10,通过培养条件、培养基组分优化,提高PHB产量,发酵小试初步确定摇瓶发酵条件与发酵罐发酵条件的相对一致性;通过提取条件优化提高PHB的提取效率,从而最大化PHB产量;最后对实验中获得的提取物进行纯化分析,判断其结构、纯度等。首先,从浙江省各地（绍兴、宁波、金华、杭州、台州、丽水、温州）采集的土壤（主要来源有河底淤泥、排污口岸泥土、花坛土壤、菜地土壤等）中分离筛选芽孢杆菌菌株416株。通过对PHB的定性、定量筛选等手段获得较高产PHB菌株,同时进行连续传代培养以获得PHB产量及遗传性状稳定的目的菌株。其次,采用单因素法优化发酵条件,培养基中的碳源、氮源及两者比例。利用响应面法研究对PHB产量影响较大的4个因素（蔗糖浓度、牛肉膏浓度、初始pH、培养温度）之间的交互关系以及最佳值。利用响应面法建立回归方程。通过计算获得最优发酵条件为：初始pH为7.40,培养温度为29.81℃,蔗糖浓度为48.48 g/L,牛肉高浓度为26.06 g/L。经过单因素及响应面优化后Bm-10的PHB产量为5.308 g/L,比筛选时PHB产量（0.76g/L）提高6.98倍。第三,在摇瓶发酵条件优化的基础上,研究菌株Bm-10应用于工业化的潜力。以菌体情况、PHB产量、PHB所占菌体百分比及溶氧情况为检测指标,在3.7L发酵罐上进行研究,为实验室后期优化生产PHB打下一定基础。第四,为了尽可能的使PHB产量最大化,还对提取工艺进行了初步研究。主要从单因素实验的基础上再进行响应面优化提取条件。从单因素实验得出当提取液中氯仿浓度75%,提取温度60℃,提取时间3.0 h。通过响应面法优化PHB提取条件,得到一个二次多项式回归模型（R2=0.9953）,模型失拟项不显著（P=0.058＞0.05）,拟合度良好,这说明采用响应面法得到的工艺参数较为可信。最终结果表明PHB的最佳提取条件：氯仿浓度69.7%,提取温度59.7℃,提取时间3.0 h。最后,将实验提取获得的粉末状或薄膜状固体采用紫外吸收光谱（UV）、核磁共振（NMR）等手段进行了分析,并与标准品进行比较。紫外吸收光谱中无杂质峰并且与PHB标准品的吸收峰一致,证明提取产物较纯,初步确定该提取物为PHB类似物,在浓硫酸降解过程中出现巴豆酸;核磁共振中的氢谱和碳谱分析可知,该提取物的结构为—[—O—CH（CH3）—CH2—CO—-]—-n。综合结果表明,从巨大芽孢杆菌内提取获得的物质为聚-β-羟基丁酸（PHB）并且纯度接近100%。

关键词：巨大芽孢杆菌聚-β-羟基丁酸发酵提取响应面法

真养产碱杆菌积累聚-β-羟基丁酸发酵条件的研究

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生物工程学报 2000年第1期16卷 103-107页

作者：堵国成陈坚高海军陈银广伦世仪无锡轻工大学生物工程学院环境生物技术研究室无锡214036

对Alcaligeneseutrophus培养过程的研究表明,氮源的限制或缺乏可刺激细胞大量积累聚β羟基丁酸(PHB),但PHB合成期氮源的完全缺乏,会导致细胞的PHB合成速率迅速下降;氧的限制也可刺激A.eutrophus合成PHB,但胞内PHB的积累量远小于氮源控... 详细信息

对Alcaligeneseutrophus培养过程的研究表明,氮源的限制或缺乏可刺激细胞大量积累聚β羟基丁酸(PHB),但PHB合成期氮源的完全缺乏,会导致细胞的PHB合成速率迅速下降;氧的限制也可刺激A.eutrophus合成PHB,但胞内PHB的积累量远小于氮源控制下的情况。在细胞的不同生长期限制氮源的供应会明显影响PHB的发酵过程,当残留菌体浓度达到20g/L至30g/L时停止流加氨水,可以得到较好的发酵水平,细胞干重,PHB含量和PHB浓度可分别达到619g/L、80.5%和49.0g/L。

关键词：真养产碱杆菌聚-β-羟基丁酸发酵积累机制

合成聚-β-羟基丁酸芽孢杆菌的筛选、鉴定及碳氮源优化

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浙江师范大学学报（自然科学版） 2010年第2期33卷 203-209页

作者：周琴蒋冬花杨叶嵇豪浙江师范大学化学与生命科学学院浙江金华321004

从污泥中分离纯化,筛选得到一株高产聚-β-羟基丁酸的菌株,标号为Bm-10,针对不同碳氮源对Bm-10产聚-β-羟基丁酸的影响进行了研究,结果表明最适碳氮源分别为葡萄糖和牛肉膏.菌株Bm-10经形态、生理生化和16S rDNA基因序列鉴定,确定为巨... 详细信息

从污泥中分离纯化,筛选得到一株高产聚-β-羟基丁酸的菌株,标号为Bm-10,针对不同碳氮源对Bm-10产聚-β-羟基丁酸的影响进行了研究,结果表明最适碳氮源分别为葡萄糖和牛肉膏.菌株Bm-10经形态、生理生化和16S rDNA基因序列鉴定,确定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium).

关键词：聚-β-羟基丁酸碳源氮源芽孢杆菌

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聚-β-羟基丁酸产生菌NS-82#的研究

微生物学通报 2001年第4期28卷 27-31页

作者：陈宏方东升陈秉良国家医药管理局福建省微生物研究所福州350007

从土壤中分离到产生聚 β 羟基丁酸 (PHB)的菌株NS 82 # ,经过菌种形态和生理生化特征的研究初步确定为芽孢杆菌。经紫外光谱、红外光谱、气相色谱、核磁共振波谱测定粗提样品 ,结果同美国AldrichChemicalCompanyInc的标准品相似。

关键词：聚-β-羟基丁酸芽孢杆菌生物降解塑料产生菌

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聚-β-羟基丁酸的微生物降解性研究

天津大学学报（自然科学与工程技术版） 2002年第1期35卷 95-97页

作者：王加宁杨合同马沛生天津大学化工学院天津300072 山东省科学院生物研究所济南250014

利用已知微生物 ,采用平板培养的方法对化学合成的聚 - β-羟基丁酸 (PHB)及生物发酵制备的 PHB进行生物降解性研究 ,测定了土壤中降解化学合成 PHB的微生物群体及种类 .结果表明 ,降解化学合成及生物制备 PHB的微生物主要为假单胞杆菌 ... 详细信息

利用已知微生物 ,采用平板培养的方法对化学合成的聚 - β-羟基丁酸 (PHB)及生物发酵制备的 PHB进行生物降解性研究 ,测定了土壤中降解化学合成 PHB的微生物群体及种类 .结果表明 ,降解化学合成及生物制备 PHB的微生物主要为假单胞杆菌 ,在土壤中的群体较大 ;化学合成的 PHB降解程度强于生物发酵法制备的 PHB.

关键词：生物降解性聚-β-羟基丁酸土壤微生物假单胞杆菌可降解塑料降解程度

利用葡萄糖发酵生产聚-β-羟基丁酸菌株的选育及其摇瓶发酵条件的研究

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生物技术 2000年第3期10卷 22-26页

作者：陈梅刘长江薛景珍李长彪沈阳农业大学辽宁沈阳110161

通过紫外线诱变筛选出能利用葡萄糖高积累PHB的突变株 -真养产碱杆菌 92 0。研究了碳源和氮源对该菌株发酵积累PHB的影响。结果表明 ,在分批摇瓶发酵中碳源和氮源的最佳浓度分别为5%和 0 33%。经过 36h的发酵菌体干重、PHB含量、PHB浓... 详细信息

通过紫外线诱变筛选出能利用葡萄糖高积累PHB的突变株 -真养产碱杆菌 92 0。研究了碳源和氮源对该菌株发酵积累PHB的影响。结果表明 ,在分批摇瓶发酵中碳源和氮源的最佳浓度分别为5%和 0 33%。经过 36h的发酵菌体干重、PHB含量、PHB浓度和PHB的产率分别为 19 3g/L、56 3%、10 86g/L和 0 2 2。

关键词：聚-β-羟基丁酸突变株摇瓶培养葡萄糖发酵

少动鞘氨醇单胞菌中结冷胶链长决定研究及高产低杂突变菌株构建

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少动鞘氨醇单胞菌中结冷胶链长决定研究及高产低杂突变菌株构建

作者：黄柯浙江理工大学

学位级别：硕士

结冷胶是由好氧型革兰氏阴性菌-少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)ATCC 31461产生的一种新型微生物胞外多糖。这种高分子量多糖因其良好的物理特性及优异的应用性能,作为悬浮剂、增稠剂、稳定剂、凝胶剂、乳化剂等,广泛应用... 详细信息

结冷胶是由好氧型革兰氏阴性菌-少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)ATCC 31461产生的一种新型微生物胞外多糖。这种高分子量多糖因其良好的物理特性及优异的应用性能,作为悬浮剂、增稠剂、稳定剂、凝胶剂、乳化剂等,广泛应用于食品、化工、制药等领域。结冷胶分子量即链长可显著影响其应用性能,且当前结冷胶生产过程中代谢副产物较多,造成提纯复杂生产成本高。目前国内外缺乏对结冷胶生物合成机理的完整认识,极大限制了其应用价值的进一步挖掘和提升,研究如何有效调控结冷胶分子量及筛选高产低杂结冷胶产生菌是扩大其应用价值、提高产率的有效途径。首先,全基因组测序及生物信息学分析显示,结冷胶产生菌少动鞘氨醇单胞菌ATCC 31461中gelC与gelE基因与多种细菌多糖链长调控基因同源,同属于PCP多糖辅聚合酶蛋白家族,推断其可能与结冷胶的链长控制相关。对gelC、gelE基因进行单敲除及双敲除,构建ΔgelC、ΔgelE单敲除及ΔgelC-ΔgelE双敲除重组菌株。通过基因敲除手段获得的三种重组菌株经发酵后,对多糖产量、发酵液粘度以及分子量进行测定,发现ΔgelC、ΔgelE重组菌株已完全失去合成结冷胶的能力,gelC、gelE基因可能影响结冷胶聚合活性、造成链长延伸过程的终止,高分子量结冷胶消失,因此在结冷胶链长调控中发挥重要作用。一个有趣的现象是,双敲除菌株的多糖产量及粘度均与野生型菌株无较大区别,但双敲除菌株所产结冷胶的分子量明显下降,野生型菌株所产结冷胶的分子量大约为1.0×10Da,双敲除菌株则更接近于1.0×10Da。因此,基于合理的猜测,考虑这两种不同分子量大小的结冷胶是否由不同的链长调控机制产生。为了解释出现此现象的原因,对三种重组菌株ΔgelC、ΔgelE、ΔgelC-ΔgelE及野生型菌株ATCC 31461进行RNA-Seq测序。在比较ΔgelC-ΔgelE菌株与ATCC 31461菌株的转录组数据中,发现差异表达基因中上调基因高于下调基因,上调表达基因可能起主要作用。以基因功能为指标对上调表达基因进行筛选,发现一个位于结冷胶生物合成基因簇外的链长调控基因。它在ATCC 31461、ΔgelC、ΔgelE菌株中表达量很低,在?gelC-?gelE双敲除菌株中对比前三者表达量分别上调了22.6405倍、6.8129倍、2.4782倍。进一步分析发现该基因全长1527 bp(基因ID:KK7＿RS0102050),其与O抗原多糖链长决定蛋白wzz/Fep E/Etk N-末端结构域的同源性为61.42%,且上下游基因功能注释分别为三磷酸腺苷酶家族(AAA family ATPase)及多糖输出蛋白(polysaccharide export protein),与结冷胶合成中聚合与输出途径所涉及基因的功能类似。因此可能在?gelC-?gelE双敲除菌株中与gelC及gelE基因起互补作用,可以成为结冷胶链长调控机制研究中新的突破点。其次,为了简化纯化步骤,提高结冷胶产量,降低生产成本,构建了高产低杂突变菌株。通过对结冷胶代谢过程中的竞争性代谢副产物念珠藻黄素和聚-β-羟基丁酸(PHB)合成的关键酶基因crt I和pha C进行敲除,获得了无色素及PHB重组菌株,简化了结冷胶提取过程。并采用紫外辐射(UV)和甲磺酸乙酯(EMS)复合诱变处理,并获得一株高产菌株Δpha C-Δcrt I-m10,最终结冷胶产率约为15.43 g/L,其结冷胶产量是野生型菌株ATCC 31461(9.6 g/L)的1.6倍,并且高于多个报道过的优化菌株。综上,本论文通过敲除少动鞘氨醇单胞菌ATCC 31461的gelC、gelE基因,证明gelC、gelE基因在结冷胶链长调控中发挥着重要作用。通过转录组测序分析发现了一个未曾研究过的链长调控基因,可能存在与gelC、gelE基因相同的链长调控功能。另外,通过敲除结冷胶合成中的代谢副产物念珠藻黄素以及PHB关键合成酶基因crt I和pha C,阻断代谢支流的碳源消耗,简化结冷胶后续纯化工艺,利用复合诱变法获得了一株具有工业应用潜力的高产突变株。这些结果为拓展结冷胶的应用性能,提升附加值,降低生产成本奠定了基础。

关键词：少动鞘氨醇单胞菌ATCC 31461 结冷胶链长调控聚-β-羟基丁酸