少动鞘氨醇单胞菌中结冷胶链长决定研究及高产低杂突变菌株构建

作     者：黄柯 

作者单位：浙江理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李欧

授予年度：2022年

学科分类：0710[理学-生物学] 081703[工学-生物化工] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 071007[理学-遗传学] 

主      题：少动鞘氨醇单胞菌ATCC 31461 结冷胶 链长调控 聚-β-羟基丁酸 

摘      要：结冷胶是由好氧型革兰氏阴性菌-少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)ATCC 31461产生的一种新型微生物胞外多糖。这种高分子量多糖因其良好的物理特性及优异的应用性能,作为悬浮剂、增稠剂、稳定剂、凝胶剂、乳化剂等,广泛应用于食品、化工、制药等领域。结冷胶分子量即链长可显著影响其应用性能,且当前结冷胶生产过程中代谢副产物较多,造成提纯复杂生产成本高。目前国内外缺乏对结冷胶生物合成机理的完整认识,极大限制了其应用价值的进一步挖掘和提升,研究如何有效调控结冷胶分子量及筛选高产低杂结冷胶产生菌是扩大其应用价值、提高产率的有效途径。首先,全基因组测序及生物信息学分析显示,结冷胶产生菌少动鞘氨醇单胞菌ATCC 31461中gelC与gelE基因与多种细菌多糖链长调控基因同源,同属于PCP多糖辅聚合酶蛋白家族,推断其可能与结冷胶的链长控制相关。对gelC、gelE基因进行单敲除及双敲除,构建ΔgelC、ΔgelE单敲除及ΔgelC-ΔgelE双敲除重组菌株。通过基因敲除手段获得的三种重组菌株经发酵后,对多糖产量、发酵液粘度以及分子量进行测定,发现ΔgelC、ΔgelE重组菌株已完全失去合成结冷胶的能力,gelC、gelE基因可能影响结冷胶聚合活性、造成链长延伸过程的终止,高分子量结冷胶消失,因此在结冷胶链长调控中发挥重要作用。一个有趣的现象是,双敲除菌株的多糖产量及粘度均与野生型菌株无较大区别,但双敲除菌株所产结冷胶的分子量明显下降,野生型菌株所产结冷胶的分子量大约为1.0×10Da,双敲除菌株则更接近于1.0×10Da。因此,基于合理的猜测,考虑这两种不同分子量大小的结冷胶是否由不同的链长调控机制产生。为了解释出现此现象的原因,对三种重组菌株ΔgelC、ΔgelE、ΔgelC-ΔgelE及野生型菌株ATCC 31461进行RNA-Seq测序。在比较ΔgelC-ΔgelE菌株与ATCC 31461菌株的转录组数据中,发现差异表达基因中上调基因高于下调基因,上调表达基因可能起主要作用。以基因功能为指标对上调表达基因进行筛选,发现一个位于结冷胶生物合成基因簇外的链长调控基因。它在ATCC 31461、ΔgelC、ΔgelE菌株中表达量很低,在?gelC-?gelE双敲除菌株中对比前三者表达量分别上调了22.6405倍、6.8129倍、2.4782倍。进一步分析发现该基因全长1527 bp(基因ID:KK7＿RS0102050),其与O抗原多糖链长决定蛋白wzz/Fep E/Etk N-末端结构域的同源性为61.42%,且上下游基因功能注释分别为三磷酸腺苷酶家族(AAA family ATPase)及多糖输出蛋白(polysaccharide export protein),与结冷胶合成中聚合与输出途径所涉及基因的功能类似。因此可能在?gelC-?gelE双敲除菌株中与gelC及gelE基因起互补作用,可以成为结冷胶链长调控机制研究中新的突破点。其次,为了简化纯化步骤,提高结冷胶产量,降低生产成本,构建了高产低杂突变菌株。通过对结冷胶代谢过程中的竞争性代谢副产物念珠藻黄素和聚-β-羟基丁酸(PHB)合成的关键酶基因crt I和pha C进行敲除,获得了无色素及PHB重组菌株,简化了结冷胶提取过程。并采用紫外辐射(UV)和甲磺酸乙酯(EMS)复合诱变处理,并获得一株高产菌株Δpha C-Δcrt I-m10,最终结冷胶产率约为15.43 g/L,其结冷胶产量是野生型菌株ATCC 31461(9.6 g/L)的1.6倍,并且高于多个报道过的优化菌株。综上,本论文通过敲除少动鞘氨醇单胞菌ATCC 31461的gelC、gelE基因,证明gelC、gelE基因在结冷胶链长调控中发挥着重要作用。通过转录组测序分析发现了一个未曾研究过的链长调控基因,可能存在与gelC、gelE基因相同的链长调控功能。另外,通过敲除结冷胶合成中的代谢副产物念珠藻黄素以及PHB关键合成酶基因crt I和pha C,阻断代谢支流的碳源消耗,简化结冷胶后续纯化工艺,利用复合诱变法获得了一株具有工业应用潜力的高产突变株。这些结果为拓展结冷胶的应用性能,提升附加值,降低生产成本奠定了基础。