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耻垢分枝杆菌转录因子Ms6174广泛调控功能的鉴定及其调控生物被膜形成的机理研究

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基因组学与应用生物学 2022年第11期41卷 2144-2155页

作者：王瑞王坤郑慧霞张景馨金梅李伟辉亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室南宁530004 广西大学生命科学与技术学院南宁530004

在前期研究中,利用耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)转座插入突变体文库筛选并鉴定到的转录因子的编码基因ms6174突变后影响了其细菌菌落表面形态。利用凝胶阻滞迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和β-半乳糖... 详细信息

在前期研究中,利用耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)转座插入突变体文库筛选并鉴定到的转录因子的编码基因ms6174突变后影响了其细菌菌落表面形态。利用凝胶阻滞迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和β-半乳糖苷酶活性实验证实了Ms6174直接负调控其自身所在基因簇的表达。同时,利用EMSA实验、DNaseⅠ酶切实验以及蛋白质与染色质DNA荧光共定位等实验发现Ms6174具有拟核结合蛋白的特性,即Ms6174是耻垢分枝杆菌中新的拟核结合蛋白。进一步通过转录组测序分析发现,相较于耻垢分枝杆菌野生型菌株,ms6174敲除菌株中有682个基因的表达水平发生了显著变化,其中有387个基因上调表达,295个基因下调表达,142个脂质代谢相关基因的表达水平发生变化。最后,检测并比较了耻垢分枝杆菌ms6174敲除突变体菌株与野生型菌株的菌落形态与生物被膜形成的差异,发现敲除ms6174后耻垢分枝杆菌的菌落表面褶皱与气液表面生物被膜增多,因此,转录因子Ms6174负调控耻垢分枝杆菌生物被膜的形成。综上,本研究鉴定了分枝杆菌中一个新的拟核结合蛋白Ms6174,其通过调控耻垢分枝杆菌脂代谢相关基因的表达而影响细菌生物被膜的形成。本研究为发掘新的广泛调控因子拟核结合蛋白提供了基础,为解析分枝杆菌生物被膜形成的调控机理提供了依据。

关键词：耻垢分枝杆菌转录调控拟核结合蛋白生物被膜

耻垢分枝杆菌ClpC和ClpX敲低表达菌株的构建及表型分析

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中国生物工程杂志 2021年第6期41卷 13-22页

作者：白嘉诚迟明哲胡亚文郝梦张雪莲复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室上海200433 宁夏回族自治区第四人民医院银川750021

蛋白质平衡稳定对细菌的生长繁殖以及应对宿主免疫压力十分重要。Clp蛋白酶复合体在结核分枝杆菌的蛋白质降解和平衡稳定中发挥重要作用。Clp蛋白酶中负责识别底物蛋白并将其解折叠的蛋白质有两种:ClpC和ClpX。为初步探究分枝杆菌中ClpC... 详细信息

蛋白质平衡稳定对细菌的生长繁殖以及应对宿主免疫压力十分重要。Clp蛋白酶复合体在结核分枝杆菌的蛋白质降解和平衡稳定中发挥重要作用。Clp蛋白酶中负责识别底物蛋白并将其解折叠的蛋白质有两种:ClpC和ClpX。为初步探究分枝杆菌中ClpC和ClpX各自的功能特点,运用CRISPRi的方法成功构建了耻垢分枝杆菌的ClpC和ClpX诱导型敲低表达菌株,并对其生长相关表型进行分析。结果显示:与野生菌株相比,ClpC和ClpX的低表达均能严重影响耻垢分枝杆菌的生长。ClpC低表达可导致菌株丧失生物膜的形成能力,而ClpX低表达则导致菌株无法维持正常细胞形态,电镜显示细胞壁不完整且细胞呈丝状化,提示ClpC和ClpX可能在分枝杆菌中具有不同的生理功能。可为后期深入开展ClpC和ClpX对分枝杆菌生理调控功能研究及新型抗结核药物筛选提供基础。

关键词：耻垢分枝杆菌 ClpC ClpX

耻垢分枝杆菌MSMEG＿3150功能的初步研究

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耻垢分枝杆菌MSMEG＿3150功能的初步研究

作者：牛宏红石河子大学

学位级别：硕士

目的:将耻垢分枝杆菌作为模式菌,探讨其MSMEG＿3150基因所编码蛋白的功能,包括:MSMEG＿3150蛋白对耻垢分枝杆菌的超微结构、生长特性、表面疏水性、脂肪酸含量以及生物膜形成的影响。方法:1.生物信息学分析1.1在Gen Bank网站查询结核分... 详细信息

目的:将耻垢分枝杆菌作为模式菌,探讨其MSMEG＿3150基因所编码蛋白的功能,包括:MSMEG＿3150蛋白对耻垢分枝杆菌的超微结构、生长特性、表面疏水性、脂肪酸含量以及生物膜形成的影响。方法:1.生物信息学分析1.1在Gen Bank网站查询结核分枝杆菌的(MTB)Fab G1所编码蛋白的氨基酸序列。将其输入至Ex PASy,在线分析Fab G1的蛋白理化性质。1.2从Gen Bank获取MTB Fab G1和野生株耻垢分枝杆菌(MS-MC155)的MSMEG＿3150基因序列和氨基酸序列,再通过Blast和DNAMAN将两者分别进行基因的同源性比对和蛋白的同源性比对。2.突变菌株的构建2.1 MSMEG＿3150基因过表达菌株构建:将目的基因MSMEG＿3150与游离型载体PMV261重组并转化,构建MSMEG＿3150过表达质粒p MV261-MSMEG＿3150质粒。将阳性质粒电转化至MS-MC155中,获得MSMEG＿3150过表达菌株。2.2 MSMEG＿3150基因沉默菌株构建:利用CRSIPRi技术构建菌株。将p Tet-d Cas9质粒电转至耻垢分枝杆菌中,获得MS-d Cas9菌株,PCR验证;设计2条针对MSMEG＿3150基的单链sg RNA oligo序列;退火形成双链DNA并磷酸化,将双链DNA连接到p Grna载体中,构建p Grna-MSMEG＿3150质粒,将阳性质粒电转至MS-d Cas9感受态中,获得MSMEG＿3150沉默菌株。3.MSMEG＿3150蛋白的功能研究(1)以MS-MC155为对照组,MSMEG＿3150过表达株和沉默株为实验组,对各菌株进行抗酸染色。(2)采用光学显微镜、扫描电镜和透射电镜,观察各菌株菌体形态和细胞壁结构。(3)细菌聚集实验和刚果红实验检测细菌表面疏水性。(4)气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)测定脂肪酸成分与含量。(5)测定细菌在不同条件下的生长曲线,检测各菌株的生存能力。(6)将各菌株进行成膜性培养,结晶紫染色法定量生物膜形成。结果:1.预测了Fab G1为疏水性蛋白、稳定蛋白。MTB Fab G1和MS-MC155 MSMEG＿3150的基因序列同源性高达77.56%,而蛋白的同源性高达81.18%。2.成功构建了耻垢分枝杆菌MSMEG＿3150过表达菌株和MSMEG＿3150沉默菌株。3.MSMEG＿3150蛋白的功能研究(1)各菌株抗酸染色的结果显示,过表达株菌体较长,染色明显加深。(2)扫描电镜观察各菌株,结果显示过表达MSMEG＿3150会导致菌体变长,沉默株细菌表面褶皱增多。透射电镜观察各菌株,显示过表达株的细胞壁显著增厚,沉默株与野生株相比,细胞壁变薄。(3)细菌聚集实验结果显示,在不含Tween80的情况下,过表达株的沉淀菌较野生株和沉默株明显增多,表明过表达株的细菌更易聚集。刚果红实验发现过表达株染色最深,即表面疏水性增强。(4)绘制各菌株的生长曲线,发现在正常条件下培养60h后,过表达株的生存能力强于野生株和沉默株,但在缺氧条件下,各菌株间的差异不明显。(5)GS-MS检测结果显示,过表达株的脂质成分C16:0、C18:0、C18:1n9c、C24:0的含量高于其他菌株。(6)观察各菌株的成膜性培养,在培养72h和120h时,过表达株较其他两株均形成褶皱明显更多且致密的生物膜,相反,沉默株只能形成一层薄薄的生物膜,且膜不完整。(7)结晶紫定量生物膜显示,过表达株生物膜形成显著增多,沉默株形成的生物膜最少。结论:1.MTB Fab G1和MS-MC155 MSMEG＿3150的基因序列同源性高达77.56%,而蛋白的同源性高达81.18%。2.MS-MS155的MSMEG＿3150基因所编码蛋白与该菌的超微结构(包括菌体长度和细胞壁厚度)、生长特性、表面疏水性相关。3.MSMEG＿3150基因所编码蛋白与MS-MS155的脂肪酸合成和生物膜的形成相关。

关键词：结核分枝杆菌耻垢分枝杆菌 FabG1 生物膜脂肪酸合成

耻垢分枝杆菌培养方法及抗酸染色初染方法的优化改良

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中国组织化学与细胞化学杂志 2022年第1期31卷 68-73页

作者：郭亚豪李玲万金磊康子乾顾加群黄继炜侯隽石河子大学医学院临床医学系石河子832000 石河子大学医学院医学教学实验中心石河子832000 石河子大学医学院基础医学系石河子832000

目的评价3种常见培养基及抗酸染色6种初染方法在耻垢分枝杆菌培养与染色鉴定中的优缺点,筛选适于耻垢分枝杆菌生长的最佳培养条件,并对其染色鉴定方法进行优化。方法分别以液体营养肉汤(静置、晃动培养),固体血琼脂、普通营养琼脂培养... 详细信息

目的评价3种常见培养基及抗酸染色6种初染方法在耻垢分枝杆菌培养与染色鉴定中的优缺点,筛选适于耻垢分枝杆菌生长的最佳培养条件,并对其染色鉴定方法进行优化。方法分别以液体营养肉汤(静置、晃动培养),固体血琼脂、普通营养琼脂培养基培养耻垢分枝杆菌24 h、48 h、72 h,对比生长情况;将抗酸染色法中石碳酸复红染色步骤分别以常规加热、70℃水浴、微波炉低火、卫生纸覆盖、室温冷染、及37℃温箱孵育等方法操作,对比染色效果与石炭酸复红用量。结果相同时间内,耻垢分枝杆菌生长速度为:固体培养基培养>液体培养基晃动培养>液体培养基静置培养,3种培养基培养48 h时均可获得理想菌量。与常规加热抗酸染色法相比,70℃水浴法、微波炉低火法着色清晰鲜艳,其他染色方法染色效果欠佳。石炭酸复红用量为:常规加热法>37℃温箱孵育法>卫生纸覆盖法>70℃水浴法=微波炉低火法。结论普通培养基即可满足耻垢分枝杆菌营养要求,充足氧气有助于其快速生长;70℃水浴法和微波炉低火法优于传统染色加热法染色效果,且石炭酸复红染液用量少,可作为鉴定耻垢分枝杆菌的优化实验方法。

关键词：耻垢分枝杆菌抗酸染色石炭酸复红

耻垢分枝杆菌与结核分枝杆菌抗原的交叉免疫应答研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2017年第4期37卷 275-280页

作者：曹俊卢锦标谢安平徐苗王国治沈小兵陈保文郭述良重庆医科大学附属第一医院呼吸与危重症学科 400016 中国食品药品检定研究院结核病疫苗室北京100050

目的探讨耻垢分枝杆菌（Mycobacterla smegmatis，MS）与结核分枝杆菌（Mycobacteria tuberculosis,MTB）抗原及其免疫原性的交叉情况。方法以低温超声破碎方法提取MS和MTB菌体抗原．通过Westernblot观察菌体抗原与抗血清的交叉免疫应... 详细信息

目的探讨耻垢分枝杆菌（Mycobacterla smegmatis，MS）与结核分枝杆菌（Mycobacteria tuberculosis,MTB）抗原及其免疫原性的交叉情况。方法以低温超声破碎方法提取MS和MTB菌体抗原．通过Westernblot观察菌体抗原与抗血清的交叉免疫应答。将超声破碎的菌体抗原与不完全弗氏佐剂混匀后肌肉注射于小鼠，免疫后7d以ELISPOT技术及流式细胞学技术检测小鼠脾脏淋巴细胞经不同细菌抗原分别刺激后产生的各类细胞因子水平，ELISA技术检测血清中抗体效价水平。结果MS与MTB间存在一些交叉抗原。经两细菌致敏的小鼠均能对不同分枝杆菌抗原产生以细胞免疫为主的免疫应答，CIM^＋及CD8^＋T淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ水平均较未免疫组明显增高（P〈0．05），对非分枝杆菌属布氏杆菌的对照抗原几乎不产生细胞免疫应答。结论MS与MTB间存在这些共同抗原使MS致敏动物能引起针对结核分枝杆菌特异性免疫应答，为MS用于结核新疫苗佐剂等研究提供科学依据。

关键词：结核分枝杆菌耻垢分枝杆菌交叉抗原免疫应答

表达绿色荧光蛋白的重组耻垢分枝杆菌感染THP-1巨噬细胞模型的建立

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细胞与分子免疫学杂志 2022年第9期38卷 789-793页

作者：李敏英王楚彤袁美丽卢思彤钱中清李柏青许涛汪洪涛慢性疾病免疫学基础与临床安徽省重点实验室蚌埠医学院检验医学院免疫学教研室蚌埠医学院检验医学院临床检验诊断学教研室安徽蚌埠233030

目的建立表达绿色荧光蛋白(GFP)的耻垢分枝杆菌感染THP-1巨噬细胞模型,对耻垢分枝杆菌进行快速定位和直观检测,为探究结核发病机制以及研制新型结核疫苗提供一种示踪工具。方法以pEGFP-N1质粒为模板采用PCR扩增出增强型绿色荧光蛋白(EG... 详细信息

目的建立表达绿色荧光蛋白(GFP)的耻垢分枝杆菌感染THP-1巨噬细胞模型,对耻垢分枝杆菌进行快速定位和直观检测,为探究结核发病机制以及研制新型结核疫苗提供一种示踪工具。方法以pEGFP-N1质粒为模板采用PCR扩增出增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列,获得EGFP的编码基因,将扩增产物克隆到载体pALACE上,建立重组质粒pALACE-EGFP。利用电穿孔技术将pALACE-EGFP转化到耻垢分枝杆菌中,通过潮霉素抗性筛选重组耻垢分枝杆菌克隆,扩大培养后涂片观察,并进行荧光显微镜镜检。再用重组耻垢分枝杆菌感染THP-1巨噬细胞,观察是否有GFP表达。结果正确构建重组质粒pALACE-EGFP;荧光显微镜下观察重组耻垢分枝杆菌,证实EGFP在重组耻垢分枝杆菌中表达,并且THP-1巨噬细胞被感染后发出绿色荧光。结论表达EGFP蛋白的重组耻垢分枝杆菌的成功建立,为结核分枝杆菌的感染和致病机制研究奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白(GFP) 耻垢分枝杆菌结核病

耻垢分枝杆菌诱导中性粒细胞胞外诱捕网形成的研究

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中国预防兽医学报 2019年第11期41卷 1154-1158页

作者：臧鑫鑫党光辉王忠星刘虹秀崔子寅崔莹莹宋宁宁刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队

中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是中性粒细胞抵御病原微生物重要的防御机制之一,NETs能够在体内外条件下捕获并杀灭病原微生物。为研究模式菌株-耻垢分枝杆菌(MS)与中性粒细胞的相互作用,本研究通过分离牛外周血中性粒细胞,将标记红色荧光... 详细信息

中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是中性粒细胞抵御病原微生物重要的防御机制之一,NETs能够在体内外条件下捕获并杀灭病原微生物。为研究模式菌株-耻垢分枝杆菌(MS)与中性粒细胞的相互作用,本研究通过分离牛外周血中性粒细胞,将标记红色荧光的MS与中性粒细胞共孵育,通过激光共聚焦观察NETs的形成;采用Pi-coGreen~?dsDNA试剂盒定量分析胞外ds DNA的释放量;并且通过菌落计数统计MS的存活情况。结果显示,MS能够诱导中性粒细胞形成NETs,胞外游离DNA的释放量随着时间的延长而逐渐增多,与对照组相比差异极显著(p分枝杆菌重要蛋白功能的研究提供参考依据。

关键词：耻垢分枝杆菌中性粒细胞中性粒细胞胞外诱捕网

耻垢分枝杆菌MSMEG_6281过表达对菌株生长和形态的影响

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微生物学通报 2016年第7期43卷 1547-1554页

作者：姜涛任丽萍臧师竹张翠丽辛毅大连医科大学生物技术系辽宁大连116044 大连医科大学生物化学与分子生物学教研室辽宁大连116044

【目的】耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis mc2155,mc2155)MSMEG_6281为结核分枝杆菌自溶素Rv3717的同源蛋白,通过建立过表达MSMEG_6281的耻垢分枝杆菌菌株,推测该蛋白对耻垢分枝杆菌肽聚糖代谢的影响。【方法】利用RT-PCR方法检... 详细信息

【目的】耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis mc2155,mc2155)MSMEG_6281为结核分枝杆菌自溶素Rv3717的同源蛋白,通过建立过表达MSMEG_6281的耻垢分枝杆菌菌株,推测该蛋白对耻垢分枝杆菌肽聚糖代谢的影响。【方法】利用RT-PCR方法检测乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)作用后MSMEG_6281基因的表达变化;以耻垢分枝杆菌基因组DNA为模板,采用PCR技术克隆MSMEG_6281基因,构建分枝杆菌表达质粒p VV16-MSMEG_6281,进一步建立MSMEG_6281过表达的耻垢分枝杆菌菌株;利用生长曲线检测MSMEG_6281过表达对耻垢分枝杆菌生长的影响;利用扫描电子显微镜分析MSMEG_6281过表达引起的耻垢分枝杆菌形态变化。【结果】EMB处理引起MSMEG_6281基因表达上调;构建了过表达MSMGE_6281的耻垢分枝杆菌菌株(mc2155/p VV16-MSMEG_6281);过表达MSMGE_6281的耻垢分枝杆菌生长缓慢,菌体形态由短杆状转变为长杆状。【结论】MSMGE_6281的过表达可改变耻垢分枝杆菌形态。MSMGE_6281的功能与细胞壁肽聚糖水解相关,在mc2155细胞壁形态维持方面发挥重要作用。

关键词： MSMEG_6281 耻垢分枝杆菌细胞形态肽聚糖水解酶

耻垢分枝杆菌中LprO蛋白过表达促进巨噬细胞凋亡

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现代生物医学进展 2022年第21期22卷 4001-4008页

作者：徐书琴沈莉芳刘含梅唐雨婷张鹭复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室上海200438 复旦大学生命科学学院微生物系上海200438

目的:探究分枝杆菌脂蛋白LprO对分枝杆菌-巨噬细胞相互作用的影响。方法:使用在线网站分析耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,M.smeg)LprO蛋白的CD4^(+)T、CD8^(+)T以及细胞毒性T细胞(Cytotoxic T Lymphocytes,CTL)抗原表位数量,评估LprO蛋白的免疫原性。构建lprO过表达的重组耻垢分枝杆菌M.smeg::pMV261-lprO,以转入空载质粒pMV261的M.smeg::pMV261菌株作为对照,分析过表达lprO对M.smeg菌株以及细菌-巨噬细胞互作的影响。结果:LprO蛋白中预测的CD4^(+)T、CD8^(+)T以及CD8^(+)CTL细胞表位数与Ag85A蛋白相当,具有较好的研究潜力。经实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)验证,M.smeg::pMV261-lprO菌株中,lprO表达量显著高于对照菌株,过表达菌株构建成功。lprO过表达不改变M.smeg菌落形态、细菌形态、细菌体外生长能力和巨噬细胞内生长能力。细菌侵染巨噬细胞Raw264.7,流式细胞技术检测显示,M.smeg::pMV261-lprO在细胞侵染前期能显著促进巨噬细胞凋亡。结论:分枝杆菌LprO蛋白可能具备与Ag85A蛋白相当的T细胞表位数,能在激起宿主的免疫反应中发挥较为重要的作用。在M.smeg中过表达LprO后能诱导侵染前期的巨噬细胞凋亡,参与细菌-宿主相互作用。综上,LprO蛋白或许有作为新型疫苗成分或药物靶标的潜力。

关键词：耻垢分枝杆菌脂蛋白 LprO 抗原表位凋亡