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副溶血弧菌耐热直接溶血毒素抑制人肺腺癌细胞活性的研究

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中国人兽共患病学报 2019年第1期35卷 54-58,65页

作者：马燕杨靖亚李诗怡喻文娟上海海洋大学食品学院上海201306 上海海洋大学上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心上海201306 农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估试验室上海201306 上海海洋大学水产与生命学院上海201306

目的海洋细菌毒素抗肿瘤是近年来兴起的用于癌症治疗的新思路。本文旨在研究耐热直接溶血毒素(TDH)对人肺腺癌细胞SPC-A-1细胞的抑制作用。方法利用DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex A-50、葡聚糖G-75层析的方法,从海洋细菌-副溶血弧菌ATCC33... 详细信息

目的海洋细菌毒素抗肿瘤是近年来兴起的用于癌症治疗的新思路。本文旨在研究耐热直接溶血毒素(TDH)对人肺腺癌细胞SPC-A-1细胞的抑制作用。方法利用DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex A-50、葡聚糖G-75层析的方法,从海洋细菌-副溶血弧菌ATCC33846的代谢物中分离纯化得到纯度较高的耐热直接溶血毒素(TDH)。通过MTT法、细胞划痕试验、凋亡试验、caspase-3活性试验比较TDH作用于不同细胞的半抑制剂浓度IC50,研究了TDH对人肺腺癌细胞SPC-A-1细胞的作用。结果人结肠上皮细胞NCM460、人肝成纤维细胞LO2、人肺腺癌细胞SPC-A-1在TDH处理24h之后,细胞的半抑制剂浓度IC50分别为151μg/mL、118μg/mL和6.7μg/mL,正常细胞的IC50高出肺腺癌细胞近20倍。在低于5μg/mL浓度下,TDH能剂量依赖性抑制SPC-A-1细胞的生长、增殖和迁移能力。流式细胞法和荧光试剂检测表明:5μg/mL的TDH能诱导33%的SPC-A-1细胞发生早期凋亡,并激活caspase-3。结论 TDH可能通过激活caspase-3途径诱导细胞凋亡,从而抑制SPC-A-1细胞的生长和增殖。

关键词：海洋毒素耐热直接溶血毒素抗肿瘤

副溶血弧菌耐热直接溶血毒素基因的克隆及原核表达

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上海海洋大学学报 2009年第3期18卷 257-262页

作者：丁莹潘迎捷赵勇孙晓红金维荣徐晓晶秦红友上海海洋大学食品学院上海201306 上海生物芯片有限公司上海201203

根据GenBank上已有的副溶血弧菌耐热直接溶血毒素的基因序列,设计并人工合成引物。将耐热直接溶血毒素的基因全长克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1上,构建重组表达载体tdhA/pGEX-4T-1和tdhS/pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达... 详细信息

根据GenBank上已有的副溶血弧菌耐热直接溶血毒素的基因序列,设计并人工合成引物。将耐热直接溶血毒素的基因全长克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1上,构建重组表达载体tdhA/pGEX-4T-1和tdhS/pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达的工程菌株。优化诱导表达条件,表达耐热直接溶血毒素。转化有重组质粒tdhA/pGEX-4T-1,tdhS/pGEX-4T-1的BL21可稳定高效地表达可溶形式的目的蛋白。表达产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,用GST琼脂糖珠柱亲和层析纯化。溶血实验表明,表达的蛋白具有溶血活性。

关键词：副溶血弧菌耐热直接溶血毒素克隆纯化蛋白

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副溶血弧菌耐热直接溶血毒素的急性毒性研究

安徽农业大学学报 2020年第3期47卷 386-390页

作者：李诗怡杨靖亚马燕郑雯静邢德纯张清卿喻文娟上海海洋大学食品学院上海201306 上海海洋大学上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心上海201306 农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估试验室上海201306 上海海洋大学水产与生命学院上海201306

为研究耐热直接溶血毒素(TDH)对实验小鼠的急性毒性,经腹腔注射实验小鼠不同浓度梯度的TDH(42.0、19.5、9.1、4.2和1.9 mg·kg^-1体重,对照组设为PBS),连续观察14 d,记录各组小鼠的死亡情况及生理反应。实验终止时进行大体解剖,摘取心... 详细信息

为研究耐热直接溶血毒素(TDH)对实验小鼠的急性毒性,经腹腔注射实验小鼠不同浓度梯度的TDH(42.0、19.5、9.1、4.2和1.9 mg·kg^-1体重,对照组设为PBS),连续观察14 d,记录各组小鼠的死亡情况及生理反应。实验终止时进行大体解剖,摘取心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏观测脏器指数,断尾采血并计数血细胞。结果表明,TDH对昆明种小鼠的半数致死量LD50为11.0 mg·kg^-1体重,小鼠的死亡主要集中发生在注射TDH后的72 h内,并且伴随着腹泻现象。各组存活的实验小鼠在注射TDH后的第5天后,精神状态基本恢复,正常进食进水。各组小鼠脏器未见明显炎症反应,小鼠血液中红细胞与白细胞数量也未见统计学差异。TDH的毒性靶器官是心脏、肺、肾脏、脾脏、胃和肠。TDH对小鼠的半数致死量和毒性靶器官及病理学表现可为TDH的进一步实际应用及研究提供科学的依据和资料。

关键词：耐热直接溶血毒素急性毒性副溶血弧菌

影响副溶血弧菌耐热直接溶血毒素表达的外界因素

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影响副溶血弧菌耐热直接溶血毒素表达的外界因素

副溶血弧菌TDH的原核表达及单克隆抗体的制备

中国食品科学技术学会第十一届年会

作者：张茜王大鹏史贤明中美食品安全联合研究中心陆伯勋食品安全研究中心微生物代谢国家重点实验室上海交通大学

本研究旨在评价不同环境因素对于副溶血弧菌耐热直接溶血素(TDH)表达的影响。耐热直接溶血素为副溶血弧茵主要致病因子,其分泌受到多种环境因素影响,如温度,pH值,胆酸盐等。本研究通过配制不同培养基,拟筛选出影响耐热直接溶血素表达的... 详细信息

本研究旨在评价不同环境因素对于副溶血弧菌耐热直接溶血素(TDH)表达的影响。耐热直接溶血素为副溶血弧茵主要致病因子,其分泌受到多种环境因素影响,如温度,pH值,胆酸盐等。本研究通过配制不同培养基,拟筛选出影响耐热直接溶血素表达的主要因素。本实验以副溶血弧茵ATCC33846为实验对象,调节盐(NaCl)浓度,pH值,培养基种类,培养温度,培养时间,牛黄胆酸(TCA)的添加量,根据正交实验表设计25组平行试验。以25组培养基分别培养副溶血弧茵ATCC33846后,将上清与等体积的1%人血细胞混合。37℃放置2h,4500 r/min离心3min后,OD检测样品吸光值,并以H=(实验组-对照组)/(A-A)×100%计算毒素溶血率。获得到溶血率最高的培养基后,再以单因素及双因素实验确定毒素活性主要影响因素。结果显示,以含有2%Nacl,2mmol TCA且pH=7的LB为培养基,42℃培养12h时副溶血弧茵所分泌的溶血毒素溶血率最高。对各因素分析后发现,TCA的加入及温度的升高可极大促进溶血毒素的分泌,而pH值的降低亦对毒素分泌起到一定的促进作用。本研究结果显示,TCA、温度及pH值均可影响副溶血弧菌直接耐热溶血素的分泌:为了降低副溶血弧菌溶血毒素对消费者健康的影响,水产品在储运期间应避免高温和低pH值环境。

关键词：副溶血弧菌耐热直接溶血毒素盐浓度温度 pH值培养基培养时间牛黄胆酸

来源： cnki会议评论

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食品与生物技术学报 2017年第3期36卷 331-335页

作者：黎晶晶黎珊珊于艳丽浙江医药高等专科学校生物与制药学院浙江宁波315000 天津市河北区疾病防疫控制中心天津300100 浙江大学明州医院浙江宁波315000

为实现副溶血性弧菌tdh基因的原核表达,采用TCBS选择培养基从贝类中筛选副溶血性弧菌疑似菌株;根据Gen Bank上已有的tdh基因序列,设计并人工合成引物,通过PCR技术鉴定副溶血性弧菌并扩增tdh基因;酶切后定向插入到p ET-28a表达载体中,构... 详细信息

为实现副溶血性弧菌tdh基因的原核表达,采用TCBS选择培养基从贝类中筛选副溶血性弧菌疑似菌株;根据Gen Bank上已有的tdh基因序列,设计并人工合成引物,通过PCR技术鉴定副溶血性弧菌并扩增tdh基因;酶切后定向插入到p ET-28a表达载体中,构建重组表达质粒p ET-28a-tdh,转入*** Rosetta中,在IPTG诱导下进行TDH蛋白表达。为制备耐热直接溶血毒素TDH单克隆抗体,用纯化的蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,成功用原核载体表达的TDH蛋白为免疫原,制得一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为T9N10。获取腹水并经Ni-NTA Resin亲和柱纯化,其稳定分泌的单克隆抗体经鉴定为Ig G1,相对分子质量约为146 000,并表现出较强的特异性。本研究为开发副溶血弧菌免疫学快速检测和深入的研究奠定良好的物质基础。

关键词：副溶血性弧菌耐热直接溶血毒素原核表达单克隆抗体制备

Western斑点印迹法检测致病性副溶血弧菌

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食品科学 2010年第20期31卷 413-416页

作者：杨靖亚张建赵勇陶妍陆小凡晁若瑜上海海洋大学食品学院上海201306

目的:对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的直接耐热溶血毒素(thermostable direct hemolysin,TDH)进行分离纯化,建立Western斑点印迹法技术检测致病性副溶血弧菌的方法。方法:用直接耐热溶血毒素免疫小鼠得到特异性抗血清,利用... 详细信息

目的:对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的直接耐热溶血毒素(thermostable direct hemolysin,TDH)进行分离纯化,建立Western斑点印迹法技术检测致病性副溶血弧菌的方法。方法:用直接耐热溶血毒素免疫小鼠得到特异性抗血清,利用棋盘方法确定免疫血清最佳工作浓度,并对致病性与非致病性副溶血弧菌分别进行特异性测定。结果:最佳免疫血清最佳工作浓度为1:3200;检测致病性副溶血弧菌为阳性,非致病性副溶血弧菌属呈阴性。结论:Western斑点印迹法技术可以特异性检测致病性副溶血弧菌,灵敏度高、操作简单,可用肉眼判定结果。

关键词：耐热直接溶血毒素 Western斑点印迹致病性副溶血弧菌检测

检测副溶血弧菌TDH斑点免疫胶体金渗滤法的研究

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中国免疫学杂志 2012年第8期28卷 733-736,751页

作者：杨靖亚陆晓帆王珍上海海洋大学海洋科学研究院上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心上海201306

目的:制备特异性检测副溶血弧菌TDH的斑点免疫胶体金渗滤测试盒(Dot immunogold filtration assay,DIG-FA)。方法:T6D4和T9H4两株抗体分别标记于金颗粒和点样于硝酸纤维素膜,通过双抗体夹心法来开发斑点免疫胶体金渗滤测试盒,并对测试... 详细信息

目的:制备特异性检测副溶血弧菌TDH的斑点免疫胶体金渗滤测试盒(Dot immunogold filtration assay,DIG-FA)。方法:T6D4和T9H4两株抗体分别标记于金颗粒和点样于硝酸纤维素膜,通过双抗体夹心法来开发斑点免疫胶体金渗滤测试盒,并对测试盒的特异性、重复性、稳定性做了分析。结果:研制的斑点免疫胶体金渗滤测试盒能够特异性检测副溶血弧菌TDH,其最低检测限达到250 ng/ml TDH,该测试盒在4℃恒温条件下保存12周后仍表现出准确和稳定的检测结果。结论:成功制备了检测副溶血弧菌TDH的斑点免疫胶体金渗滤测试盒,对现场快速检测TDH提供了可靠的测试工具。

关键词：副溶血弧菌耐热直接溶血毒素斑点免疫胶体金渗滤法快速检测

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副溶血弧菌的溶血毒素研究现况

解放军预防医学杂志 2003年第1期21卷 73-75页

作者：李志峰戴迎春第一军医大学流行病学教研室广州510515

副溶血弧菌可引起食物中毒、反应性关节炎和心脏疾病 ,其致病因子是该菌产生的多种溶血毒素 ,主要有不耐热溶血毒素、耐热直接溶血毒素、相对耐热直接溶血毒素。

关键词：副溶血弧菌不耐热溶血毒素耐热直接溶血毒素相对耐热直接熔血毒素

副溶血弧菌耐热溶血素（TDH）治疗黑色素瘤的潜力及机制研究

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副溶血弧菌耐热溶血素（TDH）治疗黑色素瘤的潜力及机制研究

作者：李诗怡上海海洋大学

学位级别：硕士

副溶血弧菌耐热直接溶血毒素（TDH）对多种细胞系具有细胞毒效应,已有研究报道证明,TDH的刺激能使细胞出现凋亡的典型形态学变化,具备潜在的抗肿瘤能力。本课题首先将通过细胞生长曲线、克隆形成、细胞周期以及细胞凋亡四个方面探究TDH... 详细信息

副溶血弧菌耐热直接溶血毒素（TDH）对多种细胞系具有细胞毒效应,已有研究报道证明,TDH的刺激能使细胞出现凋亡的典型形态学变化,具备潜在的抗肿瘤能力。本课题首先将通过细胞生长曲线、克隆形成、细胞周期以及细胞凋亡四个方面探究TDH对小鼠黑色素瘤细胞B16的抑制作用。其次通过动物肿瘤模型判断TDH的体内抗肿瘤作用。随后,通过体内急性毒性实验,初步探究TDH对KM小鼠的半数致死剂量;并通过对小鼠血液学以及生理学的检查,明确TDH对实验动物急性毒性作用的可能靶器官。最后,检测TDH刺激B16细胞后,细胞内caspase-8,caspase-3活性以及线粒体膜电位的变化初步判断TDH引起B16细胞凋亡的途径。为TDH的体内抗肿瘤研究奠定可靠的科学依据。本课题研究方法与结果如下:1.利用MTT法检测TDH对B16细胞的细胞毒性,计算TDH对B16细胞的半数抑制浓度。结果表明:24h,TDH的IC50=48.50μg/m L;48h,TDH的IC50=7.08μg/m L。***法检测TDH的作用对B16细胞生长曲线影响,通过细胞克隆形成检测TDH对B16细胞增殖能力的影响。结果表明:TDH能够以剂量依赖的方式抑制B16细胞的生长和增殖能力。3.使用C57BL/6小鼠,建立B16黑色素瘤模型。通过体内实验判断TDH的抗肿瘤作用。结果表明,6mg/kg体重TDH在对C57BL/6小鼠机体不产生毒害作用的情况下,能够减缓黑色素瘤的生长速度,此外,6mg/kg体重TDH对黑色素瘤的肺部转移也有一定的抑制作用。4.通过实验动物的急性毒性实验,判断TDH对KM小鼠的毒性大小,计算TDH对小鼠的半数致死剂量,了解TDH对小鼠毒性作用的靶器官。结果表明:TDH对KM小鼠的半数致死剂量LD=11mg/kg体重。TDH毒性作用的靶器官涉及心脏,肺,肾脏,脾脏,胃及肠。5.流式细胞技术检测TDH对B16细胞周期和凋亡的变化。结果表明:TDH作用于B16细胞48h后,细胞的周期发生变化,处于G0/G1期细胞数量显著增加而G2/M期的细胞数量减少。20μg/m L浓度TDH使细胞的凋亡率上升至20.1%。TDH通过阻滞B16细胞进入DNA合成期,诱导B16细胞凋亡的方式抑制B16细胞的生长增殖。6.利用caspase-8,3检测试剂盒快速测定TDH对B16细胞caspase-8,caspase-3激活的影响,同时利用流式细胞技术检测TDH对B16细胞的线粒体膜电位的影响。结果表明:TDH的刺激能够激活B16细胞内caspase-8和caspase-3的活性,6h和8h时,caspase-8,caspase-3的活性最高。但是,TDH并不引起B16细胞内线粒体膜电位的改变。说明TDH诱导的B16细胞凋亡与内源性细胞凋亡途径无关。通过本课题研究发现,TDH通过阻滞B16细胞进入DNA合成期,诱导B16细胞凋亡的方式抑制B16细胞的生长增殖能力。同时,TDH在体内也表现出一定的抑制黑色素瘤生长的能力。TDH体内急性毒性实验表明,TDH对实验小鼠的毒性作用靶器官有心脏,肺,肾脏,脾脏,胃以及肠。TDH能够诱导B16细胞发生凋亡,但不改变B16细胞的线粒体膜电位,说明TDH引起的细胞凋亡可能是通过细胞表面死亡受体途径发生的。这为TDH的体内抗肿瘤提供了有利的科学理论依据。

关键词：耐热直接溶血毒素黑色素瘤细胞凋亡凋亡途径