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结晶纤维素的降解

草业科学 2016年第11期33卷 2367-2374页

作者：谌恩华吴华伟李相前长江大学生命科学学院湖北荆州434025 淮阴工学院生命科学与化学工程学院江苏淮安223003

随着化石能源的日益消耗及其对环境的污染加重,寻求可再生的清洁能源已成为各国关注的焦点。木质纤维素是地球上最多的有机聚合物,对于解决能源危机具有巨大的潜力,但没有得到有效的利用,纤维素结晶区的存在是阻碍其降解的重大难题。本... 详细信息

随着化石能源的日益消耗及其对环境的污染加重,寻求可再生的清洁能源已成为各国关注的焦点。木质纤维素是地球上最多的有机聚合物,对于解决能源危机具有巨大的潜力,但没有得到有效的利用,纤维素结晶区的存在是阻碍其降解的重大难题。本文介绍了结晶纤维素的结构、解结晶方法及优良的降解菌种;纤维素酶的结构和功能;降解结晶纤维素的机制;纤维素酶的基因工程和酶工程改造。突出应加大对耐热、高效的结晶纤维素降解菌株的挖掘,并深入探究碳水化合物结合结构域的相关作用机理,这对结晶纤维素的高效降解具有重要意义。

关键词：结晶纤维素纤维素酶降解机制碳水化合物结合结构域纤维小体膨胀因子可再生能源

高速及高分辨率原子力显微镜用于研究Trichoderma reesei纤维素酶在结晶纤维素上的行为

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林产化学与工业 2014年第3期34卷 130-134页

作者：王芳芳黄峰山东大学微生物技术国家重点实验室山东济南250100

介绍了原子力显微镜(AFM)和高速原子力显微镜(HP-AFM)在研究生物大分子动态过程中的优势和Trichoderma reesei纤维素降解酶系的情况。详细综述了高速原子力显微镜和高分辨率原子力显微镜(HR-AFM)应用于研究Trichoderma reesei产生的3种... 详细信息

介绍了原子力显微镜(AFM)和高速原子力显微镜(HP-AFM)在研究生物大分子动态过程中的优势和Trichoderma reesei纤维素降解酶系的情况。详细综述了高速原子力显微镜和高分辨率原子力显微镜(HR-AFM)应用于研究Trichoderma reesei产生的3种主要纤维素酶Cel7A(TrCel7A),Cel6A(TrCel6A)和Cel7B(TrCel7B)在结晶纤维素上行为所获得的结果。可知,结晶纤维素载入催化结构域和糖苷键的水解是Cel7A运动所必须的;增加结晶纤维素的疏水面积、Cel6A和Cel7A的协同作用能提高结晶纤维素水解速率;Cel7B在起初引起结晶纤维素表面的水解之后引起润涨。可以预期HP-AFM将在阐明纤维素酶在结晶纤维素上的作用机制方面发挥巨大作用。

关键词：高速原子力显微镜纤维素酶结晶纤维素

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结晶纤维素降解酶的研究进展

安徽农业科学 2007年第9期35卷 2532-2534页

作者：吴窈画彭惠邵蔚蓝南京师范大学微生物工程重点实验室江苏南京210097

纤维素的结晶区是纤维素酶降解纤维素效率不高的制约因素。在纤维素生物降解的基础上,从产结晶纤维素酶的微生物,酶的作用机理,酶的基因工程与蛋白工程,以及结晶纤维素酶的研究前景等方面对结晶纤维素的降解作了综合评述。

关键词：结晶纤维素降解酶纤维小体

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降解结晶纤维素极耐热葡聚糖酶重组菌的构建

南京林业大学学报（自然科学版） 2006年第3期30卷 37-40页

作者：李相前邵蔚蓝江南大学工业生物技术教育部重点实验室

极耐热纤维素酶在纤维素生物转化中具有潜在的开发前景,但极耐热酶缺乏对天然纤维素的分解能力。采用基因工程方法,将极耐热内切葡聚糖酶Cel12B基因和同样极端嗜热菌来源的纤维素结合域(CBD)区域融合,构建重组质粒pET-20b-Cel12B-CBD,... 详细信息

极耐热纤维素酶在纤维素生物转化中具有潜在的开发前景,但极耐热酶缺乏对天然纤维素的分解能力。采用基因工程方法,将极耐热内切葡聚糖酶Cel12B基因和同样极端嗜热菌来源的纤维素结合域(CBD)区域融合,构建重组质粒pET-20b-Cel12B-CBD,转化至大肠杆菌JM109(DE3)诱导表达后,融合基因表达产物对结晶纤维素具有一定的分解能力。

关键词：结晶纤维素基因融合内切葡聚糖酶

热纤梭菌及纤维小体降解结晶纤维素超微结构分析

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热纤梭菌及纤维小体降解结晶纤维素超微结构分析

作者：孟凡辉山东大学

学位级别：硕士

木质纤维素占绿色植物干重的35%-50%,它是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物,其合成降解过程是自然界碳素循环的中心环节。通过酶学技术可以将木质纤维素降解转化形成可溶性糖及生物化学产品,因此这对于解决目前世界能源危机、环... 详细信息

木质纤维素占绿色植物干重的35%-50%,它是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物,其合成降解过程是自然界碳素循环的中心环节。通过酶学技术可以将木质纤维素降解转化形成可溶性糖及生物化学产品,因此这对于解决目前世界能源危机、环境污染等问题具有十分重要的意义。但是高等植物细胞壁在进化过程中形成的木质纤维素成分复杂包括纤维素、半纤维素以及果胶等难降解物质,除此之外,核心构架的纤维素是由β-1-4糖苷键连接而成的超分子化合物,这种高分子化合物在构成植物细胞壁过程中通过氢键、范德华力等作用力形成了多级高度结晶结构,这种高度结晶结构不容许微生物及酶分子在糖链之间或者是内部自由扩散,我们将植物与植物材料抵抗微生物及酶降解的各种特性统称为“生物质抗降解屏障(biomass recalcitrance)"纤维素的酶解速率较低还有一个重要原因是纤维素酶是以特定的方向、特定的接触面对纤维素底物进行降解,这一过程是一个非均质的逐层降解过程。基于以上纤维素降解过程中的问题,本研究从不同于传统酶反应动力学的底物出发,借助于宏观整体测定手段对热纤梭菌(Clostridium thermocellum)以及纤维小体降解结晶纤维素在整体上测定反应纤维素结构的各个参量,除此之外,我们通过超微手段对热纤梭菌以及纤维小体降解结晶纤维素进行观察、分析比较,试图解释热纤梭菌以及纤维小体高效降解结晶纤维素机制。研究中取得一下成果：通过扫描电子显微镜以及原子力显微镜对热纤梭菌降解结晶纤维素进行更进一步观察分析,能够观察到热纤梭菌依附于结晶纤维素对其进行降解,发现降解过程中能够形成明显沟壑形貌,并且对该结构进行定性、定量分析,初步总结热纤梭菌降解结晶纤维素作用模式。通过学习、纯化得到热纤梭菌产纤维小体,为实验室建立纤维小体纯化平台,并从热纤梭菌培养碳源、培养时间以及纤维小体最适温度、pH优化得到纤维小体活性较高的综合条件。纤维小体降解Whatman No.1滤纸及结晶纤维素PH105,通过还原糖测定纤维小体对结晶纤维素转化率,采用宏观实验手段对不同时间梯度的降解底物进行整体测定,通过红外吸收及XRD实验表明底物成分以及结晶度变化,结合切片技术借助于扫描电子显微镜以及原子力显微镜超微手段对纤维小体降解结晶纤维素进行观察,发现纤维小体从外到内首先对无定型纤维素或者是较小的结晶结构进行逐层降解,微纤丝在会发生重排但是没有出现整根微纤丝断裂的现象。通过比较分析对照Whatman No.1滤纸、纤维小体以及热纤梭菌降解Whatman No.1滤纸3D图示、表面积以及粗糙度发现热纤梭菌较纤维小体更能够对结晶纤维素表面形成形貌改变,超微结构也发现热纤梭菌不管是对整体形貌还是单根微纤丝来说,纤维小体能够对结晶纤维素形成有效降解,单根微纤丝的高度发生明显的降解变化,但是较热纤梭菌而言降解效率较低。

关键词：结晶纤维素热纤梭菌纤维小体原子力显微镜超微结构

热纤梭菌及生孢噬纤维粘菌降解结晶纤维素超分子结构分析

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热纤梭菌及生孢噬纤维粘菌降解结晶纤维素超分子结构分析

作者：袁隽玲山东大学

学位级别：硕士

高等植物所产生的纤维素是地球上最丰富的生物聚合物,其干重占整个植物细胞壁的40-60%。随着化石燃料的日益紧缺,如何将不溶性的纤维素转化成生物燃料成了人们所广泛关注的热点。然而,在亿万年的进化过程中,植物进化形成了具有超分子层... 详细信息

高等植物所产生的纤维素是地球上最丰富的生物聚合物,其干重占整个植物细胞壁的40-60%。随着化石燃料的日益紧缺,如何将不溶性的纤维素转化成生物燃料成了人们所广泛关注的热点。然而,在亿万年的进化过程中,植物进化形成了具有超分子层次特点的细胞壁结构,这种结构以纤维素为核心骨架,外侧包被半纤维素和木质素,其可以有效抵御来自微生物和动物的侵害,起到了结构屏障的作用,即“生物质抗降解屏障（biomass recalcitrance）”。目前,充分利有纤维素生物质生产乙醇等燃料的主要障碍是缺乏低成本的降解转化技术。纤维素酶对纤维素的降解是一个超分子结构局部的降解过程,有特定的方向,有特定的接触面,所以是一个非均质的过程,因此,就产生了“有限反应面积的问题”。从而,如何高效降解单根微纤丝甚至如何高效降解多根微纤丝就成了人们关注的新的科学问题。本研究主要从底物变化的角度,利用扫描电镜、原子力显微镜以及切片技术、红外光谱测定、xRD测定等分析热纤梭菌和生孢噬纤维粘菌降解前后结晶纤维素CF11和Whatman No1滤纸的结构等的变化,原位表征热纤梭菌和生孢噬纤维粘菌对结晶纤维素的高效降解效率,期待澄清热纤梭菌等对结晶纤维素的降解机制。本研究主要取得了以下研究成果： 1、以Clostridium thernocellum LQR I作为菌株的微生物厌氧培养体系的建立。近年来对于热纤梭菌降解纤维素的效率的研究大都趋于购买纤维小体纯品来对纤维素进行降解,通过对产物进行分析来表征热纤梭菌菌体对纤维索的降解效率,这具有一定的局限性。为了更有效地动态观察热纤梭菌对纤维素的降解效率,同时表征降解过程中底物的变化和产物的变化是非常有必要的,然而,微生物技术国家重点实验室均应用好氧微生物体系进行相关的研究,没有厌氧微生物体系的现成的方法,本文建立了一套本实验室适用的微生物厌氧培养体系。 2、可用于超微结构分析测定的纤维素样品处理方法构建。热线梭菌在降解结晶纤维的过程中,由于其足通过分泌纤维小体和游离的纤维索酶对纤维素进行降解的,残余的纤维素表面会留有大景的菌体及蛋白等,这对后续的XRD测定以及超微结构分析等都会造成干扰。通过利用0．05M焦磷酸钠4℃过夜反复浸泡，单蒸水100℃点沸30min的方法，结合红外测定结果发现，基本除去了纤维素表面的蛋白等杂质，适宜用于后续的实验分析。 3、首次实现原子力显微镜对纤维素整体超微结构的观测分析。本研究主要是利用原子力显微镜等观察热线梭菌等降解结晶纤维素前后，纤维素超微结构的变化，但是，原子力显微镜仅仅只能对纤维素的局部进行扫描，不能很直观地观察到整体结构的变化。通过采取对单根纤维细胞切片的连续扫描，最后利用JPK软件包将所有扫描的图片拼接起来的方法获得单根纤维细胞切片的整体扫描图，便能直观地通过整根纤维细胞的变化情况。 4、热线梭菌降解纤维素过程中纤维素结构观测及酶动力学性质分析。热纤梭菌可高效降解结晶纤维素。在48-72h内，CF11含量由90％降至60％，PH105的含景由90％降至37％。干燥样品在1625cm-1处的红外吸收峰随降解时间逐渐增强证明在一过程中纤维表面蛋白含量渐增加。XRD测定发现，降解前后结晶纤维素结晶度稳定。以PH105为碳源的发酵过程中，最终可检测到的还原糖的质量为初始底物浓度的11％;CF11为碳源的发酵液中，最终可检测到的还原糖的质量为初始底物浓度的5％。培养基的pH值由7．5下降到6．0左右。对以PH105和CF11为碳源培养的热纤梭菌隔天取样的发酵液进行SDS电泳、活性电泳考染、CMC酶活性电泳、木聚糖酶活性电泳，其结果是是相一致的，SDS电泳用肉眼可以明显分辨的蛋白条带数为18条，其中分子量大于116kDa的蛋白条带数为4条，主要蛋白分子量集中在45--116kDa之间。同时，通过活性电泳考染、CMC酶活性电泳以及木聚糖酶活性电泳图谱可以看出，主要酶活性条带集中在分离胶的上半部甚至浓缩胶点样孔附近，第4天左右具有活性的蛋白含量达到最大值。 5、热纤梭菌以及生孢噬纤维粘菌降解的结晶纤维素表面/切片的原子力显微镜观测。利用原子力显微镜对热纤梭菌降解的结晶纤维素的观测可以得出，热纤梭菌通过组装纤维小体和分泌游离的纤维素酶系统对结晶纤维素进行剥离式降解，纤维表面平坦整齐，通过切片观测发现纤维素整体微纤丝的量由表面逐渐向里减少，残余的微纤丝排列依然紧密。而生孢噬纤维粘菌由于其既不分泌游离的纤维素酶系,又不形成明显的纤维小体,其对结晶纤维素的降解主要是依靠附着在菌体之上的酶系的作用,从而留下极为明显的直径大小（～470nm）大于菌体直径大小（～270nm）的沟壑状痕迹。不管是哪种菌体降解后残余的纤维

关键词：热纤梭菌生孢噬纤维粘菌原子力显微镜结晶纤维素超微结构

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结晶纤维素与棉纤维强度

农业科技译丛（杭州） 1995年第4期 35-39页

作者： Bene.,CR 贾红梅

由纤维素结晶和链长不同引起的棉花纤维束强度差异，在测定中尚未证实，本研究旨在确定从不同棉纤维中提取的结晶微纤维素片段中纤维素链的长度，并找出这些数值与纤维束强度的关系。结晶纤纤维片段是用醋酸／硝酸试剂处理棉纤维提取的... 详细信息

由纤维素结晶和链长不同引起的棉花纤维束强度差异，在测定中尚未证实，本研究旨在确定从不同棉纤维中提取的结晶微纤维素片段中纤维素链的长度，并找出这些数值与纤维束强度的关系。结晶纤纤维片段是用醋酸／硝酸试剂处理棉纤维提取的，结晶纤维素溶于氯化锂的Ｎ，Ｎ－二甲基乙酰胺溶液。纤维素溶液的１３Ｃ核磁共振波谱可显示葡萄糖碳在１０３．１，１７４，２，７５．８，７８．５及５９．９ｐｐｍ水平上的化学位移。

关键词：结晶纤维素棉纤维强度

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纤维素超分子结构及其降解过程的表征分析

纤维素超分子结构及其降解过程的表征分析

作者：郭翰林山东大学

学位级别：硕士

木质纤维素是植物细胞壁中的主要成分,其中包含纤维素、半纤维素和果胶质。在植物细胞壁中,纤维素构成细胞壁的骨架结构,以高度结晶的有序结构微纤丝状态存在于细胞壁中。细胞壁如此复杂的天然结构,形成了多种保护机制,其抵抗微生物以... 详细信息

木质纤维素是植物细胞壁中的主要成分,其中包含纤维素、半纤维素和果胶质。在植物细胞壁中,纤维素构成细胞壁的骨架结构,以高度结晶的有序结构微纤丝状态存在于细胞壁中。细胞壁如此复杂的天然结构,形成了多种保护机制,其抵抗微生物以及酶降解的各种防御措施形成了植物的“抗降解屏障”,这给木质纤维素的综合利用带来极大困难。纤维素是以β-1,4-糖苷键连接而成的简单超分子化合物,但其超分子结构却非常复杂,由于其结构层次未加阐明,所以是何种因素限制酶解速率一直以来都是一个极具争议的科学问题。近年来,由于结构测定技术的迅速发展,初步建立了从米（100m）到纳米层次（10-9m）的表征手段,建立了相关微纤丝合成的模块。但是仍未系统全面分析不同层次下天然异质性纤维素的变化,仍未说明酸解、酶解、菌体以及天然生境中纤维素超分子结构的降解变化,因此本文基于天然纤维素不同层次的整体测定技术,比对局部超微结构的分析,引入切片技术分析异质性纤维细胞壁内部结构变化,阐明纤维素超分子结构降解过程变化。获得的主要进展如下 1、利用聚合度测定、氢键强度测定、结晶度测定以及可及度测定全面系统表征整体结构的变化,区分了纤维素超分子结构一级、二级、三级及四级结构层次,建立了相关层次与整体结构信息的关系。应用超分子结构表征方法结合切片表征分析异质性的纤维素超分子结构,提出纤维素微纤丝为作为三级结构的基本单元,其不同堆积排列方式（四级结构）的空隙仅为7nm左右,明显限制了5-7nm游离酶分子的有效扩散,微纤丝的紧密堆积形成了限制游离酶系降解的大然屏障,使得酶解过程仅发生在植物细胞壁的表面。相对酸解过程,由与H+的大小在1A以下,可以在微纤丝孔隙中自由扩散,因此可以对内部微纤丝非晶结构进行降解,使得纤维素的结晶度上升。 2、通过热纤梭菌（Clostridiem thermocellum）以及牛瘤胃天然生境系统中的微生物去对结晶纤维素类底物进行的降解分析发现,这些厌氧细菌对微纤丝的降解模式与酸解、酶解明显不同,它们可以针对整根微纤丝进行降解,从而引起结晶度的明显下降,而结晶度的降解是纤维素三级结构坍塌的表现。虽然整体结构测定的信息相对一致,但热纤梭菌与牛瘤胃天然生境系统降解模式又有区别,热纤梭可将纤维表面微纤丝重构,使得微纤丝明显变粗,然后降解孔洞逐渐扩大,完成局部区域的高效降解。而牛瘤胃天然生境系统中降解过程直接作用微纤丝,类似于内切酶的作用,在微纤丝表面不断形成切口并降解,使得微纤丝平均直径逐渐变细,形成串珠状,最后完成降解。好氧的生孢噬纤维粘菌降解模式类似于牛瘤胃中相关细菌的降解,直接破坏纤维素的三级结构,完成对整根微纤丝的高效降解,克服细胞壁形成的天然降解屏障。热纤梭菌、生孢噬纤维粘菌以及牛瘤胃生境对由于微生物菌体对结晶微纤丝这种具有高效的利用能力,使得以后结晶纤维素的高效转化研究应以菌体为主要目标,而非游离纤维素酶系。

关键词：结晶纤维素超分子结构原子力显微镜抗降解屏障

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嗜纤维菌降解纤维素机理的初步研究

嗜纤维菌降解纤维素机理的初步研究

作者：韩文彬山东大学

学位级别：硕士

在石油日益枯竭的“资源短缺”时代,可再生能源的开发日益引起各国政府的重视。与其它可再生资源的最大的区别在于,水能,风能和太阳能等均是功能单一的能源,不能提供工业原料,而生物质却身兼代替能源和替代石油基材料的两重身份。生物... 详细信息

在石油日益枯竭的“资源短缺”时代,可再生能源的开发日益引起各国政府的重视。与其它可再生资源的最大的区别在于,水能,风能和太阳能等均是功能单一的能源,不能提供工业原料,而生物质却身兼代替能源和替代石油基材料的两重身份。生物质资源的充分利用对人类社会的可持续发展将起到重要作用。作为植物细胞壁主要成份的木质纤维素是地球上最丰富的生物质类可再生资源,以其为原料生产燃料乙醇被认为是燃料乙醇产业未来发展的方向之一。但由于结晶纤维素的存在,造成纤维素酶解效率低,纤维素酶的成本过高,现阶段以生物质为原料生产的燃料乙醇在价格上还无法与汽油竞争。某些嗜纤维菌(Cytophaga)具有极强的纤维素降解能力,能在贫瘠的环境中迅速彻底地降解结晶纤维素,却只有极低的胞外纤维素降解酶活力和葡萄糖类水解产物,显示其具有独特的结晶纤维素降解体系,但具体的降解机制还不清楚。哈氏嗜纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)因其在陆地上广泛存在以及没有类似厌氧菌的纤维小体等特点被美国能源部列入微生物基因组研究计划,并于2005年完成了Cytophaga hutchinsonii ATCC 33406的4MB的全基因组序列的测定。本文从形态,生理以及生化的角度对Cytophaga hutchinsonii降解纤维素的机理进行了初步的研究。 ●在用核荧光染料Hoechst33342跟踪Cytophaga hutchinsonii ATCC33406类核的变化时,首次发现存在三个类核的状态。 ●在分批培养条件下,Cytophaga hutchinsonii ATCC 33406会从杆菌状态转变为球菌状态。球菌状态对渗透压敏感,失去了利用纤维素的能力,在合适的条件下,球菌状态又可萌发形成杆菌。杆菌状态是Cytophagahutchinsonii ATCC 33406利用纤维素的有效状态。 ●首次发现Cytophaga hutchinsonii ATCC 33406至少具有一种组成型表达的纤维素内切酶(分子量约为57,7 KDa,在细胞质、细胞膜、周质空间、细胞壁及细胞外均具有活性)。令发现三种诱导表达的纤维素内切酶。C. hut的纤维素内切酶的表达受葡萄糖效应的调控。同时,***的生长受高浓度的葡萄糖抑制。 ●Fe3+对***的生长表现出促进作用;Ca2+的存在,对***胞外纤维素内切酶产生有抑制作用,推测Ca2+的存在稳定了***外膜上的脂多糖,不利于纤维素内切酶的释放所致。 ●C. hut在滤纸上生长时,变得细长,直径为0.15μm,可以穿过0.22μm 的微孔滤膜,造成滤膜底部的纤维素水解出现透明圈。在菌体无法通过微孔的培养条件下,纤维底物上没有出现透明圈。表明C hut对纤维素的彻底降解需要菌体细胞与纤维底物的接触。同时通过电镜观察发现***在降解滤纸的过程中形成类似胞间联丝样的结构。通过对***生长过程中形态、生理、生化的研究,阐明了C. hut的纤维素内切酶在菌体上的分布、合成情况。证明菌体与底物的接触在纤维素的彻底降解中是必须的,为C. hut降解结晶纤维素机理的研究奠定了基础。

关键词：哈氏嗜纤维菌结晶纤维素类核活的非可培养状态纤维素内切酶