热纤梭菌及纤维小体降解结晶纤维素超微结构分析

作     者：孟凡辉 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王禄山

授予年度：2015年

学科分类：07[理学] 09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 0713[理学-生态学] 

主      题：结晶纤维素 热纤梭菌 纤维小体 原子力显微镜 超微结构 

摘      要：木质纤维素占绿色植物干重的35%-50%,它是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物,其合成降解过程是自然界碳素循环的中心环节。通过酶学技术可以将木质纤维素降解转化形成可溶性糖及生物化学产品,因此这对于解决目前世界能源危机、环境污染等问题具有十分重要的意义。但是高等植物细胞壁在进化过程中形成的木质纤维素成分复杂包括纤维素、半纤维素以及果胶等难降解物质,除此之外,核心构架的纤维素是由β-1-4糖苷键连接而成的超分子化合物,这种高分子化合物在构成植物细胞壁过程中通过氢键、范德华力等作用力形成了多级高度结晶结构,这种高度结晶结构不容许微生物及酶分子在糖链之间或者是内部自由扩散,我们将植物与植物材料抵抗微生物及酶降解的各种特性统称为“生物质抗降解屏障(biomass recalcitrance)纤维素的酶解速率较低还有一个重要原因是纤维素酶是以特定的方向、特定的接触面对纤维素底物进行降解,这一过程是一个非均质的逐层降解过程。基于以上纤维素降解过程中的问题,本研究从不同于传统酶反应动力学的底物出发,借助于宏观整体测定手段对热纤梭菌(Clostridium thermocellum)以及纤维小体降解结晶纤维素在整体上测定反应纤维素结构的各个参量,除此之外,我们通过超微手段对热纤梭菌以及纤维小体降解结晶纤维素进行观察、分析比较,试图解释热纤梭菌以及纤维小体高效降解结晶纤维素机制。研究中取得一下成果：通过扫描电子显微镜以及原子力显微镜对热纤梭菌降解结晶纤维素进行更进一步观察分析,能够观察到热纤梭菌依附于结晶纤维素对其进行降解,发现降解过程中能够形成明显沟壑形貌,并且对该结构进行定性、定量分析,初步总结热纤梭菌降解结晶纤维素作用模式。通过学习、纯化得到热纤梭菌产纤维小体,为实验室建立纤维小体纯化平台,并从热纤梭菌培养碳源、培养时间以及纤维小体最适温度、pH优化得到纤维小体活性较高的综合条件。纤维小体降解Whatman No.1滤纸及结晶纤维素PH105,通过还原糖测定纤维小体对结晶纤维素转化率,采用宏观实验手段对不同时间梯度的降解底物进行整体测定,通过红外吸收及XRD实验表明底物成分以及结晶度变化,结合切片技术借助于扫描电子显微镜以及原子力显微镜超微手段对纤维小体降解结晶纤维素进行观察,发现纤维小体从外到内首先对无定型纤维素或者是较小的结晶结构进行逐层降解,微纤丝在会发生重排但是没有出现整根微纤丝断裂的现象。通过比较分析对照Whatman No.1滤纸、纤维小体以及热纤梭菌降解Whatman No.1滤纸3D图示、表面积以及粗糙度发现热纤梭菌较纤维小体更能够对结晶纤维素表面形成形貌改变,超微结构也发现热纤梭菌不管是对整体形貌还是单根微纤丝来说,纤维小体能够对结晶纤维素形成有效降解,单根微纤丝的高度发生明显的降解变化,但是较热纤梭菌而言降解效率较低。