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病毒介导反义CK13基因对人鼻咽癌HNE1细胞动物模型放疗敏感性的影响

病毒介导反义CK13基因对人鼻咽癌HNE1细胞动物模型放疗敏感性的影...

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作者：孙志文昆明医科大学

学位级别：硕士

目的：鼻咽癌(nasopharyngeal careinoma, NPC)是我国南方地区的一种常见恶性肿瘤。目前NPC的主要治疗手段为放射治疗。NPC放疗后局部残灶、复发及远处转移是放疗失败的主要原因,即NPC组织中存在一定比例(10%-20%)对放射线具有抗拒作用... 详细信息

目的：鼻咽癌(nasopharyngeal careinoma, NPC)是我国南方地区的一种常见恶性肿瘤。目前NPC的主要治疗手段为放射治疗。NPC放疗后局部残灶、复发及远处转移是放疗失败的主要原因,即NPC组织中存在一定比例(10%-20%)对放射线具有抗拒作用的细胞,放射后残留的这些细胞不仅使肿瘤对放射的抗拒能力增强,而且使肿瘤更具有侵袭性,容易发生淋巴结及远处转移。因此,深入了解NPC放射敏感性的机制,探索一种能有效地增加NPC放射敏感性的治疗措施,以提高NPC的放射疗效,降低并发症,具有重要的临床意义。本课题前期实验从体外环境证明反义CK13基因在NPC治疗过程中有降敏作用。本研究将病毒介导反义CK13基因的细胞在裸鼠体内建立鼻咽癌移植瘤,旨在模拟体内环境下探索反义CK13基因在鼻咽癌治疗中的放疗敏感性的影响。为寻找一个可以在NPC治疗中提高放疗敏感性的靶基因提供实验基础。方法：1.含目的基因NPC动物模型A组(Al:HNE1细胞;A2：转染空载体HNE1细胞;A3：转染anti-CK13a的HNE1细胞;A4：转染anti-CK13b HNE1细胞)。每组随机抓取5只裸鼠。2.NPC动物模型局部注射质粒B组(B1：对照组,注射生理盐水;B2：空质粒组,注射空慢病毒质粒;B3：反义CK13a组,注射反义CK13a慢病毒质粒;B4.反义CK13b组,注射反义CK13b慢病毒质粒)。每组随机抓取5只裸鼠。3.放疗,并测量放疗前后肿瘤体积。4.处死小鼠,称重瘤体计算抑瘤率,予以病检、免疫组化、RT-qPCR及Western Blot检测。5.结果进行统计学分析。结果：1、实验期间40只裸鼠死亡率0%,存活率为100%;种瘤于左腋下后均形成明显肉眼可见的移植瘤,平均大小约400.-420mm3,成瘤率为100%。两大组移植瘤病检显示均呈现低分化鳞癌。2、我们对比照射前后的八组裸鼠的瘤体大小。在A组内,A3、A4两组肿瘤生长体积较A1、A2两组明显大,差异具有统计学意义(P0.05)。在B组内,B3、B4两组肿瘤生长体积较B1、B2两组明显大,差异具有统计学意义(P0.05)。3、称重瘤体重量并计算抑瘤率,A组以A1组为对照,A2、A3、A4组分别为-0.26%、-59.64%、-63.31%。实验组抑瘤率呈负值,说明瘤体重量较对照组A1明显增加,差异具有统计学意义(P0.05)。 B组以Bl组为对照,经计算,B2、B3、B4组分别为1.46%、-46.91%、-46.58%.实验组抑瘤率呈负值,说明瘤体重量较对照组B1明显增加,差异具有统计学意义(P0.05)。4、Western blot和RT-qPCR结果显示,实验组(A3、A4、B3、B4)的组织中CK13的表达均较对照组(A1、B1)、空载体组(A2、B2)明显降低差异具有显著性,(P13表达水平变化的同时,WNT/β-catenin的表达水平也出现变化。结论：研究发现反义CK13基因联合放射治疗使鼻咽癌HNE1细胞移植瘤体积、重量都较空载体组和对照组大,计算抑瘤率,证明体内动物模型中反义CK13降低了HNE1细胞的放疗敏感性。间接从反向证明CK13基因可能提高鼻咽癌HNE1细胞的放射敏感性。同时我们初步发现反义CK13降敏作用可能涉及到WNT/β-catenin信号通路,这为NPC治疗过程中寻找一个新的靶基因提供实验依据。

关键词：细胞角蛋白13基因的反义寡核苷酸鼻咽癌动物模型放射敏感性 β-catenin

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慢病毒介导反义CK13基因对鼻咽癌移植瘤放疗前后的影响

慢病毒介导反义CK13基因对鼻咽癌移植瘤放疗前后的影响

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作者：苗春雨昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的]分析慢病毒介导反义CK13基因对裸鼠皮下鼻咽癌移植瘤放疗前后细胞周期及凋亡的影响,论证反义CK13基因在鼻咽癌治疗中有降敏作用,为CK13基因在鼻咽癌治疗中的作用提供实验基础。[方法]本实验先培养细胞,再进行动物实验。动物实... 详细信息

[目的]分析慢病毒介导反义CK13基因对裸鼠皮下鼻咽癌移植瘤放疗前后细胞周期及凋亡的影响,论证反义CK13基因在鼻咽癌治疗中有降敏作用,为CK13基因在鼻咽癌治疗中的作用提供实验基础。[方法]本实验先培养细胞,再进行动物实验。动物实验分成O、H两组来进行。1、含目的基因NPC动物模型O组(A1：HNE1细胞;B1：转染空载体HNE1细胞;C1：转染anti-CK13a的HNE1细胞;D1：转染anti-CK13b的HNE1细胞)。2、NPC动物模型局部注射质粒H组(A2：对照组,注射生理盐水;B2:空质粒组,注射空慢病毒质粒;C2:反义CK13a组,注射反义CK13a慢病毒质粒;D2：反义CK13b组,注射反义CK13b慢病毒质粒)。3、放疗,并测量放疗前后肿瘤体积。4、处死小鼠,并取荷瘤小鼠肿瘤组织予以HE、Western blot、PCR和Tunel等检测。5、结果进行统计学分析。[结果]1、实验期间所有裸鼠无死亡情况,存活率为100%;种瘤后腋下均形成明显肉眼可见的移植瘤,成瘤率为100%。两组移植瘤病检显示均呈现低分化鳞癌。2、通过计算瘤体体积,我们发现实验组(C1、D1、C2、D2)肿瘤生长体积较对照组(A1、A2)、空载体组(B1、B2)明显增大,差异具有统计学意义(P细胞周期发现,A1、A2组和B1、B2组均无G1期阻滞,出现短暂S期阻滞,有明显的G2/M期阻滞;而C1、C2组和D1、D2组与A1、A2和B1、B2两组相比,S期阻滞没有显著变化,但G2/M期阻滞峰值明显增强,阻滞时间延长,有极显著的统计学意义(P0.05);而C1组和D1组的癌组织中凋亡率分别为19.48±2.89%和26.08±11.67%，两组相比无显著性差异(P>0.05)。C1、D1组与A1、B1组比较癌组织凋亡率明显下降(P反义CK13处理组(C1、C2组和D1、D2组)剪切体的水平较对照组(A1、A2组和B1、B2组)的表达水平显著降低,差异具有统计学意义(P细胞周期信号通路相关因子mRNA水平的变化,结果显示CK13可能与ATM和Chk2的下游信号因子通路密切相关,并且能够调控Cdc25c进行让鼻咽癌在辐射条件下阻滞于G2/M期。[结论]反义CK13基因能够显著降低鼻咽癌HNE1细胞株的放射敏感性,其作用机制可能通过延长细胞周期及减少细胞凋亡来降低鼻咽癌HNE1细胞的放射敏感性,间接证明CK13基因能够提高鼻咽癌HNE1细胞的放射敏感性;同时我们还发现CK13基因可通过调控Cdc25c信号通路使鼻咽癌在辐射条件下阻滞于G2/M期,为CK13基因成为NPC治疗的靶向基因提供实验依据。

关键词：细胞角蛋白13基因的反义寡核苷酸鼻咽癌细胞周期凋亡放射敏感性

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