病毒介导反义CK13基因对人鼻咽癌HNE1细胞动物模型放疗敏感性的影响

作     者：孙志文 

作者单位：昆明医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：余宏

授予年度：2015年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：细胞角蛋白13基因的反义寡核苷酸 鼻咽癌 动物模型 放射敏感性 β-catenin 

摘      要：目的：鼻咽癌(nasopharyngeal careinoma, NPC)是我国南方地区的一种常见恶性肿瘤。目前NPC的主要治疗手段为放射治疗。NPC放疗后局部残灶、复发及远处转移是放疗失败的主要原因,即NPC组织中存在一定比例(10%-20%)对放射线具有抗拒作用的细胞,放射后残留的这些细胞不仅使肿瘤对放射的抗拒能力增强,而且使肿瘤更具有侵袭性,容易发生淋巴结及远处转移。因此,深入了解NPC放射敏感性的机制,探索一种能有效地增加NPC放射敏感性的治疗措施,以提高NPC的放射疗效,降低并发症,具有重要的临床意义。本课题前期实验从体外环境证明反义CK13基因在NPC治疗过程中有降敏作用。本研究将病毒介导反义CK13基因的细胞在裸鼠体内建立鼻咽癌移植瘤,旨在模拟体内环境下探索反义CK13基因在鼻咽癌治疗中的放疗敏感性的影响。为寻找一个可以在NPC治疗中提高放疗敏感性的靶基因提供实验基础。方法：1.含目的基因NPC动物模型A组(Al:HNE1细胞;A2：转染空载体HNE1细胞;A3：转染anti-CK13a的HNE1细胞;A4：转染anti-CK13b HNE1细胞)。每组随机抓取5只裸鼠。2.NPC动物模型局部注射质粒B组(B1：对照组,注射生理盐水;B2：空质粒组,注射空慢病毒质粒;B3：反义CK13a组,注射反义CK13a慢病毒质粒;B4.反义CK13b组,注射反义CK13b慢病毒质粒)。每组随机抓取5只裸鼠。3.放疗,并测量放疗前后肿瘤体积。4.处死小鼠,称重瘤体计算抑瘤率,予以病检、免疫组化、RT-qPCR及Western Blot检测。5.结果进行统计学分析。结果：1、实验期间40只裸鼠死亡率0%,存活率为100%;种瘤于左腋下后均形成明显肉眼可见的移植瘤,平均大小约400.-420mm3,成瘤率为100%。两大组移植瘤病检显示均呈现低分化鳞癌。2、我们对比照射前后的八组裸鼠的瘤体大小。在A组内,A3、A4两组肿瘤生长体积较A1、A2两组明显大,差异具有统计学意义(P0.05)。在B组内,B3、B4两组肿瘤生长体积较B1、B2两组明显大,差异具有统计学意义(P0.05)。3、称重瘤体重量并计算抑瘤率,A组以A1组为对照,A2、A3、A4组分别为-0.26%、-59.64%、-63.31%。实验组抑瘤率呈负值,说明瘤体重量较对照组A1明显增加,差异具有统计学意义(P0.05)。 B组以Bl组为对照,经计算,B2、B3、B4组分别为1.46%、-46.91%、-46.58%.实验组抑瘤率呈负值,说明瘤体重量较对照组B1明显增加,差异具有统计学意义(P0.05)。4、Western blot和RT-qPCR结果显示,实验组(A3、A4、B3、B4)的组织中CK13的表达均较对照组(A1、B1)、空载体组(A2、B2)明显降低差异具有显著性,(P0.05)5、Western blot和RT-qPCR显示,CK13表达水平变化的同时,WNT/β-catenin的表达水平也出现变化。结论：研究发现反义CK13基因联合放射治疗使鼻咽癌HNE1细胞移植瘤体积、重量都较空载体组和对照组大,计算抑瘤率,证明体内动物模型中反义CK13降低了HNE1细胞的放疗敏感性。间接从反向证明CK13基因可能提高鼻咽癌HNE1细胞的放射敏感性。同时我们初步发现反义CK13降敏作用可能涉及到WNT/β-catenin信号通路,这为NPC治疗过程中寻找一个新的靶基因提供实验依据。