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CD4^(+)/CD8^(+)、B淋巴细胞与抑制/细胞毒性T细胞预测宫颈癌放疗患者放射性肠炎的价值

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中国临床研究 2022年第6期35卷 779-783页

作者：胡格徐秀理王丹夏凡中国科学院合肥肿瘤医院肿瘤综合四科安徽合肥230000

目的探讨宫颈癌放疗患者放疗前CD4^(+)/CD8^(+)、B淋巴细胞、抑制/细胞毒性T细胞联合预测放射性肠炎(RE)的价值。方法回顾性分析2019年1月至2021年3月在中国科学院合肥肿瘤医院接受放疗的87例宫颈癌患者的临床资料,根据患者是否发生R... 详细信息

目的探讨宫颈癌放疗患者放疗前CD4^(+)/CD8^(+)、B淋巴细胞、抑制/细胞毒性T细胞联合预测放射性肠炎(RE)的价值。方法回顾性分析2019年1月至2021年3月在中国科学院合肥肿瘤医院接受放疗的87例宫颈癌患者的临床资料,根据患者是否发生RE将患者分为RE组(n=27)和非RE组(n=60),并根据常见不良反应事件评价标准将RE组中≥2级者归为高症状级别组(HRE组,n=17),1级者归为低症状级别组(LRE组,n=10)。比较患者放疗前血浆CD4^(+)/CD8^(+)、B淋巴细胞、抑制/细胞毒性T细胞,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析放疗前CD4^(+)/CD8^(+)、B淋巴细胞、抑制/细胞毒性T细胞预测RE的价值。结果放疗前RE组患者抑制/细胞毒性T细胞高于非RE组患者(35.04±2.39 vs 24.86±1.05),CD4^(+)/CD8^(+)(0.87±0.10 vs 1.88±0.13)、B淋巴细胞(6.60%±1.11%vs 10.45%±0.54%)低于非RE组患者,差异有统计学意义(P细胞毒性T细胞高于LRE组,CD4^(+)/CD8^(+)、B淋巴细胞低于LRE组,差异有统计学意义(P细胞、抑制/细胞毒性T细胞值预测RE的截断值分别为1.15、4.95%、26.85。CD4^(+)/CD8^(+)预测RE的AUC为0.798(95%CI:0.733~0.901);B淋巴细胞预测RE的AUC为0.74(95%CI:0.634~0.828);抑制/细胞毒性T细胞预测RE的AUC为0.762(95%CI:0.658~0.847);三者联合预测RE的AUC为0.901(95%CI:0.795~0.941);联合检测时AUC分别明显高于三者单独检测,差异均有统计学意义(P细胞、抑制/细胞毒性T细胞与RE发生率密切相关,CD4^(+)/CD8^(+)越低,B淋巴细胞下降越明显,抑制/细胞毒性T细胞增加越高预示着细胞免疫功能失衡越严重,RE发生的概率越高。

关键词：宫颈癌放射性肠炎 CD4^(+)/CD8^(+) B淋巴细胞抑制性t细胞细胞毒性T细胞

IL-37对非小细胞肺癌PD-L1的表达及细胞毒性T细胞功能的影响

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IL-37对非小细胞肺癌PD-L1的表达及细胞毒性T细胞功能的影响

作者：朱明雪青岛大学

学位级别：硕士

目的:肺癌是最常见的癌症,发病率和死亡率均较高,免疫治疗的出现为肺癌患者带来了希望,但是表皮生长因子受体(EGFR)突变的非小细胞肺癌患者对抗PD-1/PD-L1的免疫治疗效果较差。前期研究发现白介素37(IL-37)在肿瘤进展中发挥着重要作用... 详细信息

目的:肺癌是最常见的癌症,发病率和死亡率均较高,免疫治疗的出现为肺癌患者带来了希望,但是表皮生长因子受体(EGFR)突变的非小细胞肺癌患者对抗PD-1/PD-L1的免疫治疗效果较差。前期研究发现白介素37(IL-37)在肿瘤进展中发挥着重要作用。本研究旨在探讨IL-37是否影响非小细胞肺癌PD-L1的表达进而影响细胞毒性T细胞的功能,寻求非小细胞肺癌免疫治疗耐药的潜在机制,为探索肺癌治疗提供方向。方法:本研究通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRt-PCR)和蛋白免疫印记(Western blot)检测人肺上皮细胞BEAS-2B和人肺腺癌细胞A549、PC-9、H1975中PD-L1的表达差异;分别用重组腺病毒和慢病毒内源性过表达IL-37,通过qRt-PCR和Western blot检测IL-37和PD-L1的表达情况,以不同浓度外源性rhIL-37处理PC-9细胞;利用密度梯度离心法获取健康志愿者的外周血单个核细胞(PBMC),用CD3/CD28 t细胞激活剂和白介素-2(IL-2)激活,获取活化的t细胞;将活化的t细胞分别与正常PC-9细胞和过表达IL-37的PC-9细胞进行共培养,酶联免疫吸附试验(ELISA)和流式细胞术检测共培养上清中干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(tNF-α)等细胞因子的表达;CCK8和流式细胞术检测共培养后t细胞的毒性;使用PD-L1封闭抗体进一步验证。使用统计学软件Graph Pad Prism 9对实验数据进行统计学分析,Pt-PCR和Western blot检测结果显示,与BEAS-2B相比,A549、PC-9、H1975细胞PD-L1mRNA的表达较高,差异有统计学意义(P0.05)。利用重组腺病毒和慢病毒成功过表达IL-37,差异有统计学意义(P细胞PD-L1差异无统计学意义(P>0.05);过表达IL-37的PC-9细胞PD-L1的mRNA水平和蛋白水平的表达均有升高,差异具有统计学意义(P细胞PD-L1表达无显著影响。激活的t细胞分别与PC-9细胞和过表达IL-37的PC-9细胞共培养,流式细胞术检测12项细胞因子结果显示,IFN-γ和tNF-α的分泌降低,ELISA结果与流式细胞术一致;流式细胞术检测共培养后t细胞比例,过表达IL-37的PC-9细胞降低了CD8t细胞的比例;与此同时,CCK8的结果显示t细胞的细胞毒性受到抑制,差异均有统计学意义(Pt细胞比例升高,细胞毒性和IFN-γ分泌升高,差异有统计学意义(P细胞PD-L1的表达,进而影响t细胞毒性和分泌功能。本研究揭示了EGFR19位外显子缺失的肺腺癌PD-L1免疫治疗疗效差的潜在机制之一,为肺腺癌的治疗提供了新的方向。

关键词：非小细胞肺癌 IL-37 细胞毒性T细胞 PD-L1

基于CD107a标志检测鸡细胞毒性t淋巴细胞流式方法的建立与应用

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基于CD107a标志检测鸡细胞毒性T淋巴细胞流式方法的建立与应用

作者：张凡扬州大学

学位级别：硕士

细胞毒性t淋巴细胞（Cytotoxic t lymphocytes,CtL）在细胞免疫中发挥着关键作用。测定CtL细胞的频率和功能对于疫苗评价和解析免疫保护机制具有重要意义。CD107a（Lysosome-associatedmembraneprotein 1,LAMP-1）是组成溶酶体相关膜蛋... 详细信息

细胞毒性t淋巴细胞（Cytotoxic t lymphocytes,CtL）在细胞免疫中发挥着关键作用。测定CtL细胞的频率和功能对于疫苗评价和解析免疫保护机制具有重要意义。CD107a（Lysosome-associatedmembraneprotein 1,LAMP-1）是组成溶酶体相关膜蛋白的主要部分,大多分布在溶酶体膜和内体膜上。CD107a的表面表达代表了 CtL的杀伤活性。采用流式细胞术检测CD107a在淋巴细胞上的表达克服了传统杀伤试验（如铬释放试验）需要MHC限制性匹配、过程繁琐、条件要求高的缺点。但由于缺乏有效的抗鸡CD107a的抗体,该方法在鸡上的应用至今并不理想。本研究通过制备截短的重组鸡CD107a蛋白,通过杂交瘤技术制备了识别天然CD107a的单抗,利用单抗建立了检测鸡细胞毒性T细胞的流式方法并在鸡病毒感染模型中进行了初步应用。具体研究内容如下:1.鸡CD107a基因的克隆及表达根据GenBank上已发布的chCD107a基因序列,将编码区600-1245bp按照大肠杆菌偏好性进行密码子优化并分别克隆到表达载体pEt-32a（+）和pCAGGS上,获得CD107a 截短片段重组质粒 pEt-32a-sh-chCD107a 和 pCAGGS-sh-chCD107a。将 pEt-32a-sh-chCD107a转化至Rosetta（DE3）菌株,经IPtG诱导表达获得分子量大小为39 kDa的融合蛋白trx-His-chCD107a,与预期蛋白大小一致。以鸡cDNA为模板扩增chCD107a的全长序列构建重组质粒pCAGGS-chCD107a。将重组质粒pCAGGS-sh-chCD 107a和pCAGGS-chCD 107a分别转染DF-1细胞,经间接免疫荧光（IFA）和Western-Blotting（WB）鉴定,重组chCD107a在DF-1细胞中成功获得表达。2.鸡CD107a单克隆抗体的制备、流式方法建立及初步应用以原核表达的重组蛋白trx-His-chCD107a免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术获得9株能稳定分泌chCD107a抗体的杂交瘤细胞,分别命名为2E7、2E10、2F8、2A10、2A8、3C10、3B7、3F5、4F11。ELISA检测Ig亚类和腹水效价,结果显示,3株为IgG2b,6株为IgG1,腹水效价均在1:1.3 × 107以上。IFA结果显示9株单抗均能识别真核表达的截短及全长chCD107a。WB鉴定结果显示9株单抗与原核和真核表达的chCD107a截断片段均有良好反应性,但仅有5株单抗（2E7、2E10、4F11、3F5、2F8）识别真核表达的全长chCD107a蛋白。进一步WB鉴定显示,4株单抗（2E10、2E7、3C10、4F11）可识别鸡脾脏细胞表达的糖基化chCD107a蛋白;细胞爬片结果显示,5株单抗（2E7、2E10、2F8、3F5、4F11）可识别天然 chCD107a。利用流式细胞术胞内染色鉴定单抗的反应性,结果显示,6株单抗（2E7、2E10、2F8、2A10、3C10、4F11）可检测到细胞内存在的CD107a,3F5的反应性较弱,2A8、3B7无反应。使用佛波酯（PMA）和离子霉素（Ionomycin）激活鸡脾脏细胞后进行细胞表面染色,单抗2E10可检测到鸡脾脏细胞表面明显的CD107a表达,3C10的反应性较弱,其余不识别。利用单抗2E10检测新城疫病毒强毒株感染鸡的淋巴细胞表面CD107a表达,发现感染后3d有2.3%的淋巴细胞表达CD107a,低于未感染组。利用单抗2E10结合抗鸡CD3、CD8α检测鸡传染性喉气管炎病毒活疫苗免疫鸡淋巴细胞表面CD107a的表达,结果显示免疫组CD3+、CD3+CD8α+t淋巴细胞CD107a的表达量分别为12.7%、7%,与空白组相比有显著性差异。上述结果表明,本研究成功制备了抗鸡CD107a的单克隆抗体,并建立了一种基于CD107a标志检测鸡细胞毒性t淋巴细胞的流式方法,为研究鸡t淋巴细胞的功能提供了重要的免疫学工具。

关键词： CD107a 鸡溶酶体相关膜蛋白1 重组表达单克隆抗体流式细胞术细胞毒性T细胞

抗HIV-1细胞毒性T细胞克隆的体外功能研究

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病毒学报 2016年第3期32卷 331-341页

作者：金聪涂婷牟丹蕾李群辉宋杏张海霞汤涛李涛吴昊陈华标中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心北京102206 江苏省检验医学重点实验室江苏大学医学院镇江212013 佑安医院感染中心北京100069 河北疾病预防控制中心石家庄050024 青岛大学附属医院青岛266003

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)特异细胞毒性T细胞(Cytotoxic t-lymphocytes,CtL)是产生保护性免疫应答反应的重要宿主细胞。由于HIV-1特异性CtL免疫应答反应的异质性,CtL有效抗HIV-1病毒反应的功能机制仍然不明确。为了研究HIV-1特异性Ct... 详细信息

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)特异细胞毒性T细胞(Cytotoxic t-lymphocytes,CtL)是产生保护性免疫应答反应的重要宿主细胞。由于HIV-1特异性CtL免疫应答反应的异质性,CtL有效抗HIV-1病毒反应的功能机制仍然不明确。为了研究HIV-1特异性CtL抗病毒反应的功能特性,本研究应用分离培养的HIV-1特异性CtL克隆细胞株在细胞水平直接测定抗原肽刺激CtL产生的多种功能反应。选取12株具有不同HLA分子和抗原识别表位的HIV-1特异性CtL克隆细胞平行进行多种体外功能实验,包括杀伤活性实验、脱颗粒功能实验、胞内多重细胞因子测定实验,并对CtL的细胞毒性颗粒成分和耗竭分子表达进行定量分析。本研究发现HIV-1特异性CtL克隆细胞的杀伤活性与脱颗粒功能紧密相关,杀伤活性和脱颗粒功能又与多种细胞因子的生成水平和多重功能性相关。这些发现提示HIV-1特异性CtL克隆细胞的多种功能反应之间具有协同调节的机制特点。

关键词：人类免疫缺陷病毒1型细胞毒性T细胞免疫应答反应功能实验

纳米微粒偶联抗OX40/抗AFP抗体在细胞毒性T细胞抗肝癌中的作用

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细胞与分子免疫学杂志 2014年第4期30卷 337-341页

作者：陈明水欧阳海超周山勇李洁羽叶韵斌福建医科大学教学医院福建省肿瘤医院肿瘤免疫学研究室福建福州350014 福建省肿瘤转化医学重点实验室福建福州350014 中国科学院福建物质结构研究所

目的探讨乳酸-羧基乙酸共聚物(PLGA)制备的纳米微粒偶联抗OX40及抗AFP抗体(抗OX40/抗AFP-NP)对甲胎蛋白AFP158-166抗原肽特异性细胞毒性T细胞(CtL/AFP158-166)体外杀伤肝癌细胞的影响。方法用溶剂蒸发法制备纳米微粒(NP),并与抗OX40和抗... 详细信息

目的探讨乳酸-羧基乙酸共聚物(PLGA)制备的纳米微粒偶联抗OX40及抗AFP抗体(抗OX40/抗AFP-NP)对甲胎蛋白AFP158-166抗原肽特异性细胞毒性T细胞(CtL/AFP158-166)体外杀伤肝癌细胞的影响。方法用溶剂蒸发法制备纳米微粒(NP),并与抗OX40和抗AFP共价偶联。用扫描电镜观察所制得PLGA-NP纳米颗粒的形态;ZetaPlustM粒度测定仪检测纳米微粒的粒径及电荷;用BCA蛋白定量方法检测纳米微粒偶联抗体的效率;用人外周血单核细胞诱导形成树突状细胞(DC),用AFP158-166抗原肽负载DC诱导AFP特异性的CtL/AFP158-166;分别用2-(4-碘苯)-3-(4硝基苯)-5-(2,4-磺苯基四氮唑)-2H-四唑单钠盐-1法(WSt-1)法、ELISA及乳酸脱氢酶(LDH)法分别检测抗OX40/抗AFP-NP对CtL/AFP158-166细胞增殖能力、分泌IL-2和IFN-γ及杀瘤活性的影响。结果所制得的PLGA-NP为圆形,大小较均一,粒径约为(300±42)nm,带负电荷,约为-(25.12±5.34)mV。蛋白定量显示每mg的PLGA-NP偶联约100μg抗体,偶联效率为25%;增殖和活化实验显示偶联有抗OX40的纳米微粒能显著刺激CtL的增殖、IL-2和IFN-γ的分泌;杀伤实验显示,抗OX40/抗AFP-NP能显著增强AFP特异性CtL/AFP158-166细胞对HepG2细胞特异性杀伤作用,而对SMMC-7721杀伤作用无明显效果。结论抗OX40/抗AFP-NP能刺激CtL/AFP158-166细胞的增殖、细胞因子的分泌并增强CtL/AFP158-166细胞对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤作用。

关键词：纳米微粒肝癌细胞毒性T细胞 HepG2 OX40

细胞毒性T细胞、巨噬细胞和调节性t细胞在复发性宫颈癌患者中的免疫特征分析

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免疫学杂志 2020年第7期36卷 617-622页

作者：丁燕司天斌王雨村崔静甘肃省肿瘤医院妇瘤二科兰州750050

目的探讨毒性t细胞(CtL)、巨噬细胞(tAMs)和调节性t细胞(tregs)在复发性宫颈癌患者中的免疫特征。方法收集复发性宫颈癌细胞及癌旁细胞,利用白细胞分化抗原8(CD8)、簇分化抗原68(CD68)、叉头翼状螺旋转录因子(FoxP3)分别表示CtL、tAMs和... 详细信息

目的探讨毒性t细胞(CtL)、巨噬细胞(tAMs)和调节性t细胞(tregs)在复发性宫颈癌患者中的免疫特征。方法收集复发性宫颈癌细胞及癌旁细胞,利用白细胞分化抗原8(CD8)、簇分化抗原68(CD68)、叉头翼状螺旋转录因子(FoxP3)分别表示CtL、tAMs和tregs在复发性宫颈癌中的免疫特性,程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)和程序性死亡配体1(PD-L1)表示癌细胞自身免疫,通过多重免疫荧光板检测细胞中CD8^+、CD68^+、FoxP3^+表达量,RNA免疫共沉淀法分析其在复发性宫颈癌细胞中的免疫特性。结果在肿瘤及肿周组织中CD8^+、CD68^+、FoxP3^+表达均较高,但肿周组织中FoxP3^+更高;高表达的FoxP3^+与CD8^+、CD68^+有显著相关性,可促进CD8^+、CD68^+凋亡而上调PD-L1、PD1表达。结论tregs可对肿瘤组织中的CtL和tAM进行调节,可提高宫颈癌细胞的免疫应答。

关键词：细胞毒性T细胞巨噬细胞调节性t细胞复发性宫颈癌免疫特征

急性乙型肝炎患者特异性细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞和自然杀伤t细胞的状态

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中国临床保健杂志 2012年第1期15卷 67-69页

作者：曹凌俞文娴浙江台州市第二人民医院检验科 317200 台州恩泽医疗中心(集团)路桥院区

免疫细胞在抗病毒免疫中并不是独立起作用的,而是与不同种类的免疫细胞协同合作的[1]。为此,我们研究急性乙型肝炎（AHB）患者体内特异性细胞毒性T细胞（CtL）的频率改变,及淋巴细胞亚群与自然杀伤细胞（NK）、自然杀伤t细胞（NKt）间... 详细信息

免疫细胞在抗病毒免疫中并不是独立起作用的,而是与不同种类的免疫细胞协同合作的[1]。为此,我们研究急性乙型肝炎（AHB）患者体内特异性细胞毒性T细胞（CtL）的频率改变,及淋巴细胞亚群与自然杀伤细胞（NK）、自然杀伤t细胞（NKt）间的动态改变。探讨特异性及非特异性免疫细胞在病毒清除及细胞损伤中的作用。

关键词：细胞毒性T细胞自然杀伤t细胞乙型肝炎患者自然杀伤细胞急性乙型肝炎非特异性状态免疫细胞

Chediak-Higashi综合征合并细胞毒性T细胞淋巴瘤一例

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中华血液学杂志 2020年第12期41卷 1051-1051页

作者：黄闪孙红启李慧霞王利娟郑州大学附属儿童医院血液肿瘤科郑州450018 郑州大学附属儿童医院郑州市儿童感染与免疫重点实验室郑州450018

患儿,女,8岁,因"发现颈部淋巴结肿大半个月,发热、咳嗽5 d"于2017年1月25日入院,查体:体温37.7℃,发育正常,营养中等,全身皮肤白皙,头发色浅,呈灰白色,面部、颈部、双上肢可见弥漫性褐色斑片,边界清,双下肢可见色素脱失斑。虹膜色浅,颈... 详细信息

患儿,女,8岁,因"发现颈部淋巴结肿大半个月,发热、咳嗽5 d"于2017年1月25日入院,查体:体温37.7℃,发育正常,营养中等,全身皮肤白皙,头发色浅,呈灰白色,面部、颈部、双上肢可见弥漫性褐色斑片,边界清,双下肢可见色素脱失斑。虹膜色浅,颈部双侧可触及多个肿大淋巴结,大小约4 cm×4 cm×3 cm,边界不清,活动度差,无触痛,质地中等。腹膨隆,肝肋缘下约3 cm,质韧,边锐。

关键词：颈部淋巴结肿大细胞毒性T细胞肿大淋巴结皮肤白皙色素脱失斑腹膨隆褐色斑淋巴瘤

结直肠癌中细胞毒性T细胞募集相关趋化因子及其与肠黏膜菌群的关系

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结直肠癌中细胞毒性T细胞募集相关趋化因子及其与肠黏膜菌群的关系

作者：陶寄江南大学

学位级别：硕士

目的:结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是消化道中最常见的恶性肿瘤之一。肠道菌群紊乱可促进结直肠癌的发生及发展,最近报道表明肠道菌群可能影响t细胞向CRC肿瘤组织中的运输。因此,菌群的改变可能影响CRC患者的临床结局。本研究目的... 详细信息

目的:结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是消化道中最常见的恶性肿瘤之一。肠道菌群紊乱可促进结直肠癌的发生及发展,最近报道表明肠道菌群可能影响t细胞向CRC肿瘤组织中的运输。因此,菌群的改变可能影响CRC患者的临床结局。本研究目的是评估CRC进展过程中肿瘤和邻近正常组织中主要募集细胞毒性T细胞的多种趋化因子的表达水平以及与其相关的肠黏膜菌群,并研究它们在CRC患者中的相互作用。方法:对136名CRC患者的肿瘤和配对的邻近正常组织样品进行处理,以分析主要的募集细胞毒性T细胞的趋化因子的表达水平和临床价值。(1)提取患者肠黏膜RNA,通过逆转录-实时定量聚合酶链式反应(Rt-qPCR)评估来自CRC患者配对的肿瘤和正常组织中主要募集细胞毒性T细胞的趋化因子(包括CXCL9、CXCL10、CXCL11和CCL5)的表达。(2)对患者进行随访,获得患者生存信息,通过Kaplan-Meier和Cox比例风险模型分析评估了这些趋化因子的预后意义。(3)提取肠黏膜微生物DNA,进行16S rRNA基因高通量测序后,分析101对数据质检合格的配对组织中的肠黏膜菌群特征。使用Wilcoxon符号秩检验评估肿瘤和匹配的正常组织之间的菌群成差异。使用Spearman相关性分析研究CRC肠黏膜菌群与募集细胞毒性T细胞的趋化因子之间的关联。使用PICRUSt获得菌群的功能预测。结果:(1)在136例CRC患者中,CXCL9、CXCL10和CXCL11在肿瘤中的表达高于正常组织。CXCL9在肿瘤组织中的高表达与CD8t细胞浸润的增强有关,肿瘤和正常组织中CXCL9的高表达和生存率的提高有关。(2)与正常组织相比,肿瘤组织中黏膜菌群表现出微生物多样性降低和口腔共生菌增加的特征。微生物网络分析确定了肿瘤与相邻的正常组织的黏膜相关菌群(MAM)的菌群成和结构差异。肿瘤富集的一些细菌类群Clostridium、Lachnoanaerobaculumorale、Peptostreptococcus、Fusobaterium、Oribacterium、Parvimonas和Selenomonas,在CRC黏膜相关微生物网络中具有明显的中心性(p细胞毒性T细胞募集的趋化因子和CRC患者MAM的关系表明趋化因子的表达与特定细菌类群丰度的转变相关,表明具有潜在的功能相互作用。结论:本研究发现CRC中口腔共生菌与肠道微生物之间更强的相互作用,以及MAM与肿瘤组织中主要募集细胞毒性T细胞的趋化因子之间的可变的相关性,提示CRC中趋化因子表达的调控机制可能与肠道菌群和宿主之间的相互作用相关。

关键词：结直肠癌细胞毒性T细胞趋化因子肠黏膜微生物