基于CD107a标志检测鸡细胞毒性T淋巴细胞流式方法的建立与应用

作     者：张凡 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：商绍彬;郑肖娟

授予年度：2022年

学科分类：090602[农学-预防兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：CD107a 鸡溶酶体相关膜蛋白1 重组表达 单克隆抗体 流式细胞术 细胞毒性T细胞 

摘      要：细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocytes,CTL）在细胞免疫中发挥着关键作用。测定CTL细胞的频率和功能对于疫苗评价和解析免疫保护机制具有重要意义。CD107a（Lysosome-associatedmembraneprotein 1,LAMP-1）是组成溶酶体相关膜蛋白的主要部分,大多分布在溶酶体膜和内体膜上。CD107a的表面表达代表了 CTL的杀伤活性。采用流式细胞术检测CD107a在淋巴细胞上的表达克服了传统杀伤试验（如铬释放试验）需要MHC限制性匹配、过程繁琐、条件要求高的缺点。但由于缺乏有效的抗鸡CD107a的抗体,该方法在鸡上的应用至今并不理想。本研究通过制备截短的重组鸡CD107a蛋白,通过杂交瘤技术制备了识别天然CD107a的单抗,利用单抗建立了检测鸡细胞毒性T细胞的流式方法并在鸡病毒感染模型中进行了初步应用。具体研究内容如下:1.鸡CD107a基因的克隆及表达根据GenBank上已发布的chCD107a基因序列,将编码区600-1245bp按照大肠杆菌偏好性进行密码子优化并分别克隆到表达载体pET-32a（+）和pCAGGS上,获得CD107a 截短片段重组质粒 pET-32a-sh-chCD107a 和 pCAGGS-sh-chCD107a。将 pET-32a-sh-chCD107a转化至Rosetta（DE3）菌株,经IPTG诱导表达获得分子量大小为39 kDa的融合蛋白Trx-His-chCD107a,与预期蛋白大小一致。以鸡cDNA为模板扩增chCD107a的全长序列构建重组质粒pCAGGS-chCD107a。将重组质粒pCAGGS-sh-chCD 107a和pCAGGS-chCD 107a分别转染DF-1细胞,经间接免疫荧光（IFA）和Western-Blotting（WB）鉴定,重组chCD107a在DF-1细胞中成功获得表达。2.鸡CD107a单克隆抗体的制备、流式方法建立及初步应用以原核表达的重组蛋白Trx-His-chCD107a免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术获得9株能稳定分泌chCD107a抗体的杂交瘤细胞,分别命名为2E7、2E10、2F8、2A10、2A8、3C10、3B7、3F5、4F11。ELISA检测Ig亚类和腹水效价,结果显示,3株为IgG2b,6株为IgG1,腹水效价均在1:1.3 × 107以上。IFA结果显示9株单抗均能识别真核表达的截短及全长chCD107a。WB鉴定结果显示9株单抗与原核和真核表达的chCD107a截断片段均有良好反应性,但仅有5株单抗（2E7、2E10、4F11、3F5、2F8）识别真核表达的全长chCD107a蛋白。进一步WB鉴定显示,4株单抗（2E10、2E7、3C10、4F11）可识别鸡脾脏细胞表达的糖基化chCD107a蛋白;细胞爬片结果显示,5株单抗（2E7、2E10、2F8、3F5、4F11）可识别天然 chCD107a。利用流式细胞术胞内染色鉴定单抗的反应性,结果显示,6株单抗（2E7、2E10、2F8、2A10、3C10、4F11）可检测到细胞内存在的CD107a,3F5的反应性较弱,2A8、3B7无反应。使用佛波酯（PMA）和离子霉素（Ionomycin）激活鸡脾脏细胞后进行细胞表面染色,单抗2E10可检测到鸡脾脏细胞表面明显的CD107a表达,3C10的反应性较弱,其余不识别。利用单抗2E10检测新城疫病毒强毒株感染鸡的淋巴细胞表面CD107a表达,发现感染后3d有2.3%的淋巴细胞表达CD107a,低于未感染组。利用单抗2E10结合抗鸡CD3、CD8α检测鸡传染性喉气管炎病毒活疫苗免疫鸡淋巴细胞表面CD107a的表达,结果显示免疫组CD3+、CD3+CD8α+T淋巴细胞CD107a的表达量分别为12.7%、7%,与空白组相比有显著性差异。上述结果表明,本研究成功制备了抗鸡CD107a的单克隆抗体,并建立了一种基于CD107a标志检测鸡细胞毒性T淋巴细胞的流式方法,为研究鸡T淋巴细胞的功能提供了重要的免疫学工具。