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一种基于流式细胞术的牛多细胞因子检测方法

生物工程学报 2023年第1期39卷 347-358页

作者：朱兆成夏爱鸿曹兆立李昕陈祥徐正中焦新安扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 扬州大学农业农村部农产品质量安全生物性危害因子(动物源)控制重点实验室江苏扬州225009

本研究旨在建立一种基于流式细胞术的牛多细胞因子检测方法。对前期制备并筛选出的针对牛细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α、IP-10和MCP-1的单克隆抗体进行荧光标记,与细胞表面分子抗体组合搭配,进行牛多细胞因子流式检测方法的建立和优化... 详细信息

本研究旨在建立一种基于流式细胞术的牛多细胞因子检测方法。对前期制备并筛选出的针对牛细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α、IP-10和MCP-1的单克隆抗体进行荧光标记,与细胞表面分子抗体组合搭配,进行牛多细胞因子流式检测方法的建立和优化。随后利用建立的方法进行BCG体外感染牛外周血单个核细胞的细胞因子表达规律测定,并结合CFP10-ESAT6蛋白刺激剂评价上述细胞因子作为牛结核诊断标识的潜力。建立的牛多细胞因子流式检测方法可以有效测定BCG感染牛外周血T淋巴细胞的细胞因子表达,其中IFN-γ、IL-2、TNF-α在感染40h后持续上升,而IP-10和MCP-1表达水平呈现下降趋势;对于牛外周血CD4^(+)T淋巴细胞IFN-γ、IL-2、TNF-α的联合检测能有效区分牛结核阳性和阴性样品。这一方法为牛病原菌感染、疫苗注射后细胞免疫应答水平评价以及疫病诊断提供了重要技术手段。

关键词：牛细胞因子胞内染色流式细胞术细胞免疫应答疫病诊断

结核分枝杆菌双组分系统PhoP蛋白的免疫学特性

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中国人兽共患病学报 2024年第4期40卷 352-358页

作者：李雪宁唤唤康健徐铭泽崔若囡代婷路延之薛飒柏银兰西北大学生命科学学院西安710069 空军军医大学基础医学院微生物与病原生物学教研室西安710032 空军军医大学军事医学创新中心西安710032

目的探究结核分枝杆菌双组分系统PhoP蛋白的免疫学特性。方法采用生物信息学方法预测PhoP蛋白的B细胞和T细胞表位。将Mtb H37Rv phoP基因克隆到pET-28a(+)原核表达载体上,并将重组质粒转化到E.coli BL21菌株中,经IPTG诱导表达及亲和层... 详细信息

目的探究结核分枝杆菌双组分系统PhoP蛋白的免疫学特性。方法采用生物信息学方法预测PhoP蛋白的B细胞和T细胞表位。将Mtb H37Rv phoP基因克隆到pET-28a(+)原核表达载体上,并将重组质粒转化到E.coli BL21菌株中,经IPTG诱导表达及亲和层析法纯化获得PhoP重组蛋白。用ELISA分析Mtb感染小鼠和TB患者血清中PhoP特异性抗体水平。PhoP重组蛋白经肌肉注射途径免疫小鼠,分离小鼠多抗血清,用ELISA和Western blot分别检测抗体效价和抗体特异性。分离小鼠脾细胞,用ELISpot和ELISA法分别检测分泌IFN-γ细胞频数及其分泌水平。结果经生物信息学预测发现PhoP含有24个B细胞抗原表位和11个优势T细胞表位。成功构建PhoP原核表达载体并获得纯化的PhoP蛋白。Mtb感染小鼠和TB患者血清中的PhoP特异性抗体显著升高,查准率分别为99.9%和82.5%,特异度均为100%。PhoP免疫小鼠诱导产生高水平特异性抗体,免疫小鼠脾细胞经抗原体外刺激后,IFN-γ的分泌水平和细胞频数均显著增加,IL-2和IL-10分泌水平上调。结论PhoP蛋白可诱导体液免疫应答和Th1型为主的细胞免疫。PhoP蛋白有良好的免疫原性,且具有一定的TB诊断效能。本研究为阐明PhoP在Mtb感染中的作用及其用于TB诊断奠定了一定的基础。

关键词：结核分枝杆菌双组分系统 PhoP 体液免疫应答细胞免疫应答

感染蠕虫后宿主T细胞免疫应答相关信号通路的研究进展

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2022年第2期40卷 223-227,235页

作者：何威周必英遵义医科大学寄生虫学教研室遵义563000

蠕虫感染普遍存在于亚洲、非洲和南美洲,严重影响人类健康和经济发展。蠕虫感染可启动宿主T细胞免疫应答,影响T细胞增殖与分化。宿主感染蠕虫后,转化生长因子-β/Smad、诱导共刺激分子-诱导共刺激分子配体、程序性死亡蛋白-1/程序性死... 详细信息

蠕虫感染普遍存在于亚洲、非洲和南美洲,严重影响人类健康和经济发展。蠕虫感染可启动宿主T细胞免疫应答,影响T细胞增殖与分化。宿主感染蠕虫后,转化生长因子-β/Smad、诱导共刺激分子-诱导共刺激分子配体、程序性死亡蛋白-1/程序性死亡蛋白-1配体、Toll样受体/髓样分化因子88等信号通路可参与T细胞免疫应答,信号分子相互作用可诱导T细胞增殖与分化,进而影响宿主T细胞发挥抗蠕虫感染的作用。本文就宿主感染蠕虫后T细胞免疫应答相关信号通路的研究进展进行综述。

关键词：蠕虫细胞免疫应答信号通路

细胞免疫应答变化与支气管哮喘疾病进展的相关性分析

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广东医学 2021年第3期42卷 279-282页

作者：连晓峰韩鹏李永锋许志强王东傲濮阳市安阳地区医院呼吸与危重症医学科河南安阳455000 河南省人民医院呼吸内科河南郑州450003

目的探讨细胞免疫应答变化与支气管哮喘疾病进展的相关性。方法选取95例支气管哮喘患者为观察组,选取同期体检的健康人95例为对照组,记录研究对象辅助性T细胞1(T helper cells 1,Th1)、Th2、Th17和调节性T细胞(regulatory cell,Treg)比... 详细信息

目的探讨细胞免疫应答变化与支气管哮喘疾病进展的相关性。方法选取95例支气管哮喘患者为观察组,选取同期体检的健康人95例为对照组,记录研究对象辅助性T细胞1(T helper cells 1,Th1)、Th2、Th17和调节性T细胞(regulatory cell,Treg)比例,记录白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、IL-4、γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、IL-10、IL-17、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、IL-22 mRNA和蛋白表达水平,测定研究对象血液中CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)水平,并计算CD4^(+)/CD8_(+)。结果观察组Treg和Th1细胞占比低于对照组,Th2和Th17细胞占比高于对照组,差异有统计学意义(P细胞免疫应答的异常变化密切相关。

关键词：细胞免疫应答支气管哮喘疾病进展相关性

SARS-CoV-2感染后机体抗体和细胞免疫应答的前瞻性队列研究

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SARS-CoV-2感染后机体抗体和细胞免疫应答的前瞻性队列研究

作者：姚琳军事科学院

学位级别：硕士

一、研究背景2019年底,由新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus2,SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎(Coronavirus disease 2019,COVID-19)在人间传播并引起了全球大流行。SARS-CoV-2具有传染性强、传播速度快、传播范围广的特点,对人类健康和世界公共卫生安全构成了重大威胁。长期来看,通过大规模疫苗接种建立群体免疫是最可能成功控制疫情的核心,而自然感染或接种疫苗免疫力维持时间对疫苗的设计和研发以及未来疾病流行严重程度至关重要。然而,关于人感染SARS-CoV-2后机体免疫力持久性依然不清楚。病毒感染引起的机体免疫应答,包括体液和细胞免疫应答,与病毒清除、疾病严重程度、疫苗反应和针对未来感染的保护密切相关。特别是病毒特异性中和抗体的持久性,可以指导疫苗的设计与评估。此外,由病毒感染诱导的适应性免疫应答与保护机体免受后续病毒的再次感染密切相关。然而,人感染SARS-CoV-2特异性抗体动态变化特征及持久性、T细胞动力学、以及记忆性细胞免疫应答的研究有限。因此,系统开展自然感染后机体记忆性免疫应答的研究,具有紧迫性和必要性,研究结果可为疫苗的研制和疫情防控措施的制定提供科学依据。二、研究目的通过开展SARS-CoV-2感染患者感染后不同时间点病毒特异性抗体和记忆性T和B细胞的研究,掌握SARS-CoV-2感染后抗体应答的动力学规律,阐明病毒记忆性T细胞和B细胞免疫应答特征及持久性,为疫苗设计和疫情防控提供重要的科学依据。三、研究方法本研究结合横断面和前瞻性队列研究设计,于中国山东、江苏和浙江纳入经实验室确诊的SARS-CoV-2感染者和新冠肺炎大流行前一般健康对照人群为研究对象。获得研究对象知情同意后,采集SARS-CoV-2感染后急性期至感染后3个月、6个月、9个月和14个月血液标本,分离血清和外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),同时收集研究对象人口学基本信息、流行病学资料和临床信息。采用酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清样本中免疫球蛋白M(Immunoglobulin M,IgM)和免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)抗体;通过替代病毒中和实验(Surrogate virus neutralization test,s VNT)、假病毒中和实验(Pseudovirus neutralization test,p VNT)和活病毒中和实验(Live virus-based neutralization test,LVNT)检测血清中和抗体(Neutralizing antibody,NAb);利用酶联免疫斑点实验(Enzyme linked immunospot assay,ELISpot)和流式细胞术(Flow cytometry,FC)检测PBMCs样本中SARS-CoV-2特异性记忆T和B细胞。运用Microsoft excel建立数据库,利用Graph Pad Prism 8.0进行数据分析和绘图。分类变量资料的比较采用χ检验或Fisher确切概率法。采用Mann-Whitney U检验和Wilcoxon配对符号秩检验分别对两组独立样本和配对样本抗体滴度和记忆性T和B细胞数量进行比较;采用Kruskal-Wallis检验和Friedman检验分别对多个独立样本和多个配对样本的抗体滴度和记忆性T和B细胞数量进行比较,并用错误发现率(False discovery rate,FDR)进行校正。相关性检验采用Spearman秩相关。所有检验均为双侧检验,P细胞动力学通过建立疫情早期25例SARS-CoV-2感染患者的前瞻性队列,采集其感染后1～7天、8～14天、15～21天、28天和3个月不同时间节点共计112份血清样本及感染后3个月20份PBMCs样本,对病毒特异性抗体和T细胞应答进行检测。血清中受体结合结构域(Receptor-binding domain,RBD)蛋白特异性IgM(RBD-IgM)抗体在SARS-CoV-2感染后1周的阳性率为33.3%,感染后2周所有患者RBD-IgM抗体阳性,感染后15～21天抗体水平达到峰值,感染后3个月阳性率为75%,且抗体水平迅速下降。与RBD-IgM抗体相似,感染后1周血清核衣壳(Nucleocapsid,N)蛋白特异性IgG(N-IgG)抗体阳性率为33.3%,感染后15～21天抗体水平达到峰值,感染后2周至3个月,抗体阳性率为100%。刺突(Spike,S)蛋白特异性IgG(S-IgG)抗体在感染后1周的阳性

关键词：新型冠状病毒抗体细胞免疫应答动力学持久性

COVID-19疫苗免疫应答及保护效力研究进展

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中国公共卫生 2021年第5期37卷 896-901页

作者：杨朝国刘继芬蒋宏成都中医药大学医学技术学院四川成都611137

由严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)感染引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)为全球性流行病和公共卫生威胁。人们付出了巨大的努力去认识和治疗COVID-19,更可取的是防止感染及临床疾病形成。COVID-19疫苗包括灭活疫苗、腺病毒... 详细信息

由严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)感染引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)为全球性流行病和公共卫生威胁。人们付出了巨大的努力去认识和治疗COVID-19,更可取的是防止感染及临床疾病形成。COVID-19疫苗包括灭活疫苗、腺病毒载体疫苗、mRNA疫苗和亚单位疫苗接种都可诱导绝大多数受试成人产生强体液免疫应答和细胞免疫应答,形成高滴度S蛋白特异性抗体、中和抗体及强Th1细胞因子应答,疫苗对成人COVID-19的保护效力>70%。多个因素会影响疫苗保护效力。

关键词： 2019冠状病毒疾病疫苗体液免疫应答细胞免疫应答效力

不同形貌的介孔二氧化硅纳米材料对肝细胞癌细胞免疫应答的影响

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不同形貌的介孔二氧化硅纳米材料对肝细胞癌细胞免疫应答的影响

作者：彭婷玮宁夏医科大学

学位级别：硕士

第1章不同形貌介孔二氧化硅纳米颗粒的制备、OVA负载及表征目的设计并构建球状、短棒状和长棒状介孔二氧化硅纳米颗粒(Mesoporous silica nanoparticles,MSNs),以其作为药物递送载体负载肿瘤抗原卵清蛋白(ovalbumin,OVA),提高肿瘤抗原... 详细信息

第1章不同形貌介孔二氧化硅纳米颗粒的制备、OVA负载及表征目的设计并构建球状、短棒状和长棒状介孔二氧化硅纳米颗粒(Mesoporous silica nanoparticles,MSNs),以其作为药物递送载体负载肿瘤抗原卵清蛋白(ovalbumin,OVA),提高肿瘤抗原负载效率,并探讨介孔二氧化硅纳米颗粒的形貌对OVA负载、释放的影响。方法采用两相法首先合成球状介孔二氧化硅纳米颗粒,并在此基础上,通过改变CTAB模板量制备短棒状和长棒状的介孔二氧化硅纳米颗粒,然后借助扫描电镜、透射电镜、氮气吸附脱吸附曲线等手段对其形态、均一性、介孔结构、表面电位及稳定性等进行了表征;采用超声探针法负载卵清白蛋白(OVA)至不同形貌的介孔二氧化硅纳米材料上,借助BCA试剂盒测量并比较三者负载及释放抗原前后溶液内OVA的含量,评估了不同形貌的介孔二氧化硅纳米颗粒负载、释放OVA的能力。结果采用两相法成功合成了三种不同形貌的介孔二氧化硅纳米颗粒,分别为粒径100nm的球状(MSN-S)、长度200nm的短棒状(MSN-M)和长度600nm的长棒状(MSN-L)介孔二氧化硅纳米颗粒。形貌及介孔结构表征结果显示,三种形貌的MSNs的介孔孔径和孔容相近,MSN-L具有最大的比表面积,MSN-S具有最小的比表面积。OVA负载与释放结果显示,不同形貌的MSNs负载及释放OVA的效率存在显著差异,MSN-L的OVA负载及释放效率最高,MSN-M次之,MSN-S的OVA负载及释放效率最低。结论成功构建并表征了球状(MSN-S)、短棒状(MSN-M)和长棒状介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN-L),并成功负载OVA至其表面(OVA@MSNs)。三种形貌中,MSNL借助其最大的比表面积,表现出最高的OVA负载与释放效率,MSN-M次之,MSN-S最低。第2章体外评价不同形貌OVA@MSNs调控抗肝细胞癌细胞免疫应答水平目的在细胞层面,体外探讨不同形貌的OVA@MSNs在抗肝细胞癌细胞免疫应答中的关键环节上发挥的调控作用,即DCs成熟活化、交叉提呈抗原、诱导T淋巴细胞成熟活化、细胞毒性T淋巴细胞靶向杀伤肝癌细胞,为改善肝癌免疫治疗效果提供新思路。方法通过CCK-8实验、荧光探针标记和免疫荧光染色,评价不同形貌OVA@MSNs对骨髓来源树突状细胞(Bone Marrow-Derived Dendritic Cells,BMDCs)的毒性作用、内化摄取抗原能力、成熟活化程度及交叉提呈抗原作用;通过ELISA、AM/PI双染色进一步评价了不同形貌OVA@MSNs刺激后的BMDCs诱导初始T淋巴细胞成熟活化的水平及活化的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)靶向杀伤负载OVA的小鼠肝癌Hepa1-6细胞的能力。结果三种形貌的MSNs对BMDCs不具有显著的毒性作用。并且,BMDCs摄取MSN-L负载OVA的含量显著高于其他形貌MSNs,其表面CD80、CD86和SIINFEKL分子的表达也明显强于其他形貌的MSNs。进一步共培养活化BMDCs与T淋巴细胞后发现,OVA@MSN-L刺激后的BMDCs促进T淋巴细胞分泌TNF-α、IFN-γ、IL-12p70的含量显著高于其他形貌的OVA@MSNs。通过提取不同形貌OVA@MSNs组BMDCs诱导活化的CD8+T淋巴细胞,与负载OVA的小鼠肝癌细胞共培养后,发现由OVA@MSN-L组BMDCs所诱导活化的CD8+T淋巴细胞对小鼠肝癌细胞的杀伤作用最强。结论以MSN-L作为载体负载OVA后,不仅能够显著促进树突状细胞内化摄取抗原、成熟活化及交叉提呈抗原,还能够通过诱导下游的淋巴细胞活化、增强CTL对负载OVA的小鼠肝癌Hepa1-6细胞的靶向杀伤作用,来进一步提高细胞免疫应答的强度,在改善肝癌免疫治疗效果方面具有一定的潜能。第3章体内评估不同形貌OVA@MSNs调控肝细胞癌细胞免疫应答水平目的在动物层面,体内探讨不同形貌OVA@MSNs诱导机体发生抗肝细胞癌细胞免疫应答的能力,并进一步对不同形貌OVA@MSNs诱导的抗肝细胞癌细胞免疫应答抑制肝癌细胞生长、治疗肝细胞癌的效果进行了评估。方法采用IVIS小动物活体荧光成像技术评价了不同形貌的OVA@MSNs靶向淋巴结的能力;构建小鼠皮下肝癌模型,施加不同形貌OVA@MSNs干预后,采用流式细胞术检测了不同处理组小鼠淋巴结内CD11c、CD80和CD86的表达水平及脾脏CD3、CD4和CD8的表达水平,评价体内抗肿瘤细胞免疫应答活化情况;通过检测小鼠肿瘤体积、肿瘤重量和小鼠体重,进一步评估不同形貌OVA@MSNs诱导的细胞免疫应答对肝细胞癌的抑制作用;分离不同形貌OVA@MSNs处理后的健康小鼠的主要器官,制备切片并进行HE染色,同时收集血液进行了肝肾功能检测,评价了不同形貌OVA@MSNs的体内生物安全性。结果IVIS结果显示,足垫注射三种形貌的

关键词：介孔二氧化硅纳米颗粒形貌 OVA 抗原负载与释放肝细胞癌树突状细胞细胞毒性T淋巴细胞靶向杀伤作用细胞免疫应答免疫治疗

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重组减毒沙门氏菌疫苗候选株研究进展

中国禽业导刊 2023年第5期40卷 45-51页

作者：沈子城孟闯谢添刘炜高冉耿士忠扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室江苏扬州225009 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 扬州大学农业农村部农产品质量安全生物性危害因子(动物源)控制重点实验室江苏扬州225009 扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室江苏扬州225009

疫苗是人和动物疾病防控的有效措施之一。减毒沙门氏菌不仅可以被用作疫苗,也被用作疫苗载体制备表达外源基因的重组疫苗。目前,重组减毒沙门氏菌疫苗主要通过重组载体(含宿主菌-载体平衡致死系统)或重组染色体来表达外源靶基因。重组... 详细信息

疫苗是人和动物疾病防控的有效措施之一。减毒沙门氏菌不仅可以被用作疫苗,也被用作疫苗载体制备表达外源基因的重组疫苗。目前,重组减毒沙门氏菌疫苗主要通过重组载体(含宿主菌-载体平衡致死系统)或重组染色体来表达外源靶基因。重组靶基因的减毒沙门氏菌疫苗,进入动物或人体内后,不仅能够表达蛋白诱导相应的抗体,而且沙门氏菌也能促进细胞免疫应答,增强免疫效果。近些年,伴随着基因工程的发展,越来越多针对细菌、寄生虫和肿瘤的重组减毒沙门氏菌疫苗候选株被构建,具有良好的免疫保护能力,展现出良好的应用前景。本文重点介绍重组减毒沙门氏菌疫苗研究和应用的最新进展。

关键词：减毒沙门氏菌平衡致死系统细胞免疫应答重组疫苗免疫保护疫苗载体疫苗候选株寄生虫

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机体抗结核分枝杆菌的免疫机制研究进展

中国病原生物学杂志 2020年第2期15卷 233-237页

作者：陶思雨姜石松申元英张建波韩婷婷李洪柳云南大理大学基础医学院微生物学及免疫学教研室云南大理671000 牛津--大理免疫研究中心云南大理671000 英国牛津大学 UK 0X37AQ 云南大理市第二人民医院云南大理671000

结核菌是全球因感染而致死的主要因素。特别是结核合并艾滋病病毒感染及结核耐药菌株的出现,结核病发病率又明显现上升,形势非常严峻。了解结核分枝杆菌与机体的免疫关系及结核分枝杆菌如何逃逸免疫对结核病的预防、诊断和治疗尤其重要... 详细信息

结核菌是全球因感染而致死的主要因素。特别是结核合并艾滋病病毒感染及结核耐药菌株的出现,结核病发病率又明显现上升,形势非常严峻。了解结核分枝杆菌与机体的免疫关系及结核分枝杆菌如何逃逸免疫对结核病的预防、诊断和治疗尤其重要。因此,本文在结核免疫中抗原提呈机制的概述、免疫逃逸中相关细胞因子和结核分枝杆菌自身因素的介绍、再次激活机体免疫的较新方法(如:利用结核重组重叠肽和T细胞反应缺陷的方法)、抗结核病中结核分枝杆菌细胞壁和休眠基因的研究以及结核疫苗展望等方面进行了总结。

关键词：结核病结核分枝杆菌细胞免疫应答免疫逃逸综述