不同形貌的介孔二氧化硅纳米材料对肝细胞癌细胞免疫应答的影响

作     者：彭婷玮 

作者单位：宁夏医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘兴晖;徐天兆

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：介孔二氧化硅纳米颗粒 形貌 OVA 抗原负载与释放 肝细胞癌 树突状细胞 细胞毒性T淋巴细胞 靶向杀伤作用 肝细胞癌 细胞免疫应答 免疫治疗 

摘      要：第1章不同形貌介孔二氧化硅纳米颗粒的制备、OVA负载及表征目的设计并构建球状、短棒状和长棒状介孔二氧化硅纳米颗粒(Mesoporous silica nanoparticles,MSNs),以其作为药物递送载体负载肿瘤抗原卵清蛋白(ovalbumin,OVA),提高肿瘤抗原负载效率,并探讨介孔二氧化硅纳米颗粒的形貌对OVA负载、释放的影响。方法采用两相法首先合成球状介孔二氧化硅纳米颗粒,并在此基础上,通过改变CTAB模板量制备短棒状和长棒状的介孔二氧化硅纳米颗粒,然后借助扫描电镜、透射电镜、氮气吸附脱吸附曲线等手段对其形态、均一性、介孔结构、表面电位及稳定性等进行了表征;采用超声探针法负载卵清白蛋白(OVA)至不同形貌的介孔二氧化硅纳米材料上,借助BCA试剂盒测量并比较三者负载及释放抗原前后溶液内OVA的含量,评估了不同形貌的介孔二氧化硅纳米颗粒负载、释放OVA的能力。结果采用两相法成功合成了三种不同形貌的介孔二氧化硅纳米颗粒,分别为粒径100nm的球状(MSN-S)、长度200nm的短棒状(MSN-M)和长度600nm的长棒状(MSN-L)介孔二氧化硅纳米颗粒。形貌及介孔结构表征结果显示,三种形貌的MSNs的介孔孔径和孔容相近,MSN-L具有最大的比表面积,MSN-S具有最小的比表面积。OVA负载与释放结果显示,不同形貌的MSNs负载及释放OVA的效率存在显著差异,MSN-L的OVA负载及释放效率最高,MSN-M次之,MSN-S的OVA负载及释放效率最低。结论成功构建并表征了球状(MSN-S)、短棒状(MSN-M)和长棒状介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN-L),并成功负载OVA至其表面(OVA@MSNs)。三种形貌中,MSNL借助其最大的比表面积,表现出最高的OVA负载与释放效率,MSN-M次之,MSN-S最低。第2章体外评价不同形貌OVA@MSNs调控抗肝细胞癌细胞免疫应答水平目的在细胞层面,体外探讨不同形貌的OVA@MSNs在抗肝细胞癌细胞免疫应答中的关键环节上发挥的调控作用,即DCs成熟活化、交叉提呈抗原、诱导T淋巴细胞成熟活化、细胞毒性T淋巴细胞靶向杀伤肝癌细胞,为改善肝癌免疫治疗效果提供新思路。方法通过CCK-8实验、荧光探针标记和免疫荧光染色,评价不同形貌OVA@MSNs对骨髓来源树突状细胞(Bone Marrow-Derived Dendritic Cells,BMDCs)的毒性作用、内化摄取抗原能力、成熟活化程度及交叉提呈抗原作用;通过ELISA、AM/PI双染色进一步评价了不同形貌OVA@MSNs刺激后的BMDCs诱导初始T淋巴细胞成熟活化的水平及活化的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)靶向杀伤负载OVA的小鼠肝癌Hepa1-6细胞的能力。结果三种形貌的MSNs对BMDCs不具有显著的毒性作用。并且,BMDCs摄取MSN-L负载OVA的含量显著高于其他形貌MSNs,其表面CD80、CD86和SIINFEKL分子的表达也明显强于其他形貌的MSNs。进一步共培养活化BMDCs与T淋巴细胞后发现,OVA@MSN-L刺激后的BMDCs促进T淋巴细胞分泌TNF-α、IFN-γ、IL-12p70的含量显著高于其他形貌的OVA@MSNs。通过提取不同形貌OVA@MSNs组BMDCs诱导活化的CD8+T淋巴细胞,与负载OVA的小鼠肝癌细胞共培养后,发现由OVA@MSN-L组BMDCs所诱导活化的CD8+T淋巴细胞对小鼠肝癌细胞的杀伤作用最强。结论以MSN-L作为载体负载OVA后,不仅能够显著促进树突状细胞内化摄取抗原、成熟活化及交叉提呈抗原,还能够通过诱导下游的淋巴细胞活化、增强CTL对负载OVA的小鼠肝癌Hepa1-6细胞的靶向杀伤作用,来进一步提高细胞免疫应答的强度,在改善肝癌免疫治疗效果方面具有一定的潜能。第3章体内评估不同形貌OVA@MSNs调控肝细胞癌细胞免疫应答水平目的在动物层面,体内探讨不同形貌OVA@MSNs诱导机体发生抗肝细胞癌细胞免疫应答的能力,并进一步对不同形貌OVA@MSNs诱导的抗肝细胞癌细胞免疫应答抑制肝癌细胞生长、治疗肝细胞癌的效果进行了评估。方法采用IVIS小动物活体荧光成像技术评价了不同形貌的OVA@MSNs靶向淋巴结的能力;构建小鼠皮下肝癌模型,施加不同形貌OVA@MSNs干预后,采用流式细胞术检测了不同处理组小鼠淋巴结内CD11c、CD80和CD86的表达水平及脾脏CD3、CD4和CD8的表达水平,评价体内抗肿瘤细胞免疫应答活化情况;通过检测小鼠肿瘤体积、肿瘤重量和小鼠体重,进一步评估不同形貌OVA@MSNs诱导的细胞免疫应答对肝细胞癌的抑制作用;分离不同形貌OVA@MSNs处理后的健康小鼠的主要器官,制备切片并进行HE染色,同时收集血液进行了肝肾功能检测,评价了不同形貌OVA@MSNs的体内生物安全性。结果IVIS结果显示,足垫注射三种形貌的OVA@MSNs后,小鼠腘窝淋巴结附近的荧光强度显著高于单独注射OVA,其中,注射OVA@MSN-L的小鼠腘窝淋巴结附近的荧光强度最高,且24h后淋巴结部位仍有OVA滞留。流式细胞术结果表明,注射OVA@MSN-L的小鼠体内CD11c、CD80、CD86、CD3、CD4和CD8的表达水平显著高于其他处理组,极大提高了小鼠体内抗肝癌细胞免疫应答水平,有效抑制体内肝癌细胞的生长,表现出最强的肝癌抑制作用。小鼠肝肾功能结果与主要器官HE染色结果提示,三种形貌的OVA@MSNs不具备明显的器官毒性。结论OVA@MSN-L通过延长抗原滞留时间增强淋巴结靶向性,其募集树突状细胞、诱导树突状细胞成熟活化的能力最强,体内CTL成熟活化水平最高,表现出最高的抗肝癌细胞免疫应答强度与最强的肝癌细胞生长抑制作用,极大地改善了肝癌免疫治疗效果。