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采用Cre-loxP技术构建肝脏特异性Trappc11基因敲除小鼠模型

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肝脏 2024年第9期29卷 1137-1140,1153页

作者：郑帆帆李霞高枫李梦瑶杨彦玲李优磊延安大学医学院陕西716000 延安市肥胖防治研究重点实验室延安大学附属医院内分泌代谢科

目的采用Cre-loxP系统构建肝脏组织特异性Trappc11基因敲除小鼠(Trappc11^(flox/flox)-Alb-Cre^(+/-))模型以探究脂肪肝的发病机制。方法用带有loxP位点的Trappc11纯合子小鼠(Trappc11^(flox/flox))和带有Alb-Cre的转基因小鼠(Alb-Cre^(+/-))进行杂交,对其子代进行基因型鉴定。筛选出Trappc11^(flox/+)-Alb-Cre^(+/-)小鼠,将其与Trappc11^(flox/flox)小鼠进一步杂交可获得Trappc11肝脏特异性敲除鼠。将3~4周龄的Trappc11^(flox/flox)-Alb-Cre^(+/-)、Trappc11^(flox/+)-Alb-^(Cre+/-)和Trappc11^(flox/flox)-Alb-^(Cre-/-)小鼠各3只,提取各组织脏器中的DNA,检测Trappc11的敲除效率和特异性。然后,在mRNA和蛋白质水平进一步验证。于第4周开始监测摄食量和体重等指标。结果我们成功繁育出肝脏特异性Trappc11基因敲除鼠,敲除心、脾、肺、肾、胰腺、肌肉、脂肪和脑组织中该基因表达未受影响,mRNA水平敲除效率达85%以上且TRAPPC11蛋白水平下降。该敲除鼠目前生长状态良好,饮食饮水正常,可用于后期繁殖与机制研究。结论已经构建成功的Trappc11flox/flox-Alb-Cre+/-鼠将为探索Trappc11在肝脏中的生理病理作用提供在体模型。

关键词：转运蛋白颗粒复合物亚基11 Cre-loxP重组酶系统组织特异性敲除

应用Cre-loxP系统构建肝组织特异性ATF5基因敲除小鼠模型

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中国医药工业杂志 2021年第12期52卷 1609-1614页

作者：白思益陈会帕梅拉·帕尔哈提邓晴朱建伟袁运生上海交通大学药学院教育部细胞工程及抗体药物工程研究中心上海200240

应用Cre-loxP重组酶系统构建肝组织特异性ATF5基因敲除小鼠(ATF5^(Flox/Flox)-Alb-Cre^(+/-))模型。采用Alb-Cre工具鼠,用带有Cre-loxP系统的ATF5 Flox纯合子小鼠(ATF5^(Flox/Flox))和带有Alb-Cre杂合子(Alb-Cre^(+/-))的转基因小鼠进行杂交,对产生的子代利用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)进行基因型鉴定。筛选出子代ATF5^(Flox/-)-Alb-Cre^(+/-)小鼠,其与ATF5^(Flox/Flox)小鼠进一步交配可获得ATF5^(Flox/Flox)-Alb-Cre^(+/-)小鼠,该基因型小鼠的肝细胞基因组中ATF5的外显子缺失。选取雌性、7~8周龄的ATF5^(Flox/Flox)-Alb-Cre^(+/-)和ATF5^(Flox/Flox)-Alb-Cre^(-/-)小鼠各3只,采用实时荧光定量PCR测定ATF5在肝、肾、心和脑组织中的表达量,并采用常规苏木精-伊红(HE)染色,观察2种小鼠各脏器的组织形态。结果表明,该系统可实现ATF5在肝脏中的特异性敲除,敲除效率可达到97%。此外,2种小鼠的肝、肾、肺、心和脑组织形态无明显改变,可为研究ATF5在肝脏中的生物学功能提供体内模型参考。

关键词：转录激活因子5 Cre-loxP重组酶系统组织特异性敲除基因型鉴定

巨噬细胞特异性敲除一磷酸腺苷激活依赖性蛋白激酶基因的小鼠模型构建

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心肺血管病杂志 2019年第7期38卷 788-792页

作者：郑帅刘燕朴春梅刘婷婷王吉静王绿娅杜杰首都医科大学附属北京安贞医院-北京市心肺血管疾病研究所心血管生物研究室心血管重塑相关疾病教育部重点实验室北京市心血管重大疾病协同创新中心 100029 首都医科大学附属北京安贞医院-北京市心肺血管疾病研究所动脉粥样硬化研究室 100029 河南省人民医院&郑州大学人民医院心功能科

目的:构建巨噬细胞特异性敲除一磷酸腺苷激活依赖性蛋白激酶(AMPK)基因的小鼠模型,并观察对血压的影响。方法:利用胚胎显微注射法构建AMPKα1基因第3外显子两端携带loxP位点的小鼠模型,和集落刺激因子1受体启动子诱导表达Cre酶的小鼠模... 详细信息

目的:构建巨噬细胞特异性敲除一磷酸腺苷激活依赖性蛋白激酶(AMPK)基因的小鼠模型,并观察对血压的影响。方法:利用胚胎显微注射法构建AMPKα1基因第3外显子两端携带loxP位点的小鼠模型,和集落刺激因子1受体启动子诱导表达Cre酶的小鼠模型,交配繁育出巨噬细胞特异性敲除AMPK的小鼠模型。鼠尾DNA做PCR鉴定基因型,腹腔注射他莫昔芬诱导敲除AMPK,Real-timePCR检测小鼠骨髓细胞AMPKRNA水平。检测Cre阴性小鼠注射与不注射他莫昔芬的血压差异,以及Cre阴性和阳性小鼠注射他莫昔芬5d后的血压差异。结果:鼠尾DNAPCR鉴定出AMPKα1loxP为纯合阳性、且Cre为阴性或阳性的小鼠。与Cre阴性小鼠相比,他莫昔芬显著降低了Cre阳性小鼠骨髓细胞AMPKmRNA[(0.9263±0.1293)vs.(0.47±0.04657),P敲除鼠血压显著低于对照组[收缩压(123.5±3.577)vs.(107.5±4.814)mmHg,P=0.037]。结论:成功构建巨噬细胞特异性敲除AMPK的小鼠模型,证实敲除鼠血压降低。

关键词：巨噬细胞一磷酸腺苷激活依赖性蛋白激酶组织特异性敲除小鼠模型

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生长激素受体基因敲除小鼠模型

中国实验动物学报 2018年第5期26卷 662-666页

作者：王小双米艾孙捷王丹曾丽冉丽媛吴英杰大连医科大学重大疾病基因工程模式动物研究所基因工程模式动物国际联合研究中心辽宁大连116044 吉林大学附属第一医院干部病房长春130000

由脑垂体合成并分泌的生长激素(GH)不仅控制机体生长发育,还在许多代谢疾病中起关键调控作用。GH的生物学功能通过与其表面受体(GHR)结合而启动,基于分子生物学技术构建各种GHR敲除小鼠模型成为揭示GH调控机制的基础。利用Cre-LoxP重组... 详细信息

由脑垂体合成并分泌的生长激素(GH)不仅控制机体生长发育,还在许多代谢疾病中起关键调控作用。GH的生物学功能通过与其表面受体(GHR)结合而启动,基于分子生物学技术构建各种GHR敲除小鼠模型成为揭示GH调控机制的基础。利用Cre-LoxP重组酶系统,迄今已在小鼠全身或组织特异性(如肝,骨骼肌,脂肪,巨噬细胞和胰岛β细胞等)敲除ghr基因,并从中探索GH/GHR信号转导及其与其他信号通路的相互作用。本文综述并讨论了这些ghr基因敲除小鼠模型的表型特征和应用,从不同方面介绍了GH/GHR相关信号通路研究现状。

关键词：生长激素受体全身敲除组织特异性敲除代谢疾病 Cre/LoxP系统

生长素诱导的蛋白降解技术在线虫精子发生中的应用

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中国科学：生命科学 2022年第8期52卷 1247-1260页

作者：陈新艳张琦陈联万王宁马肖静单进赵艳梅苗龙中国科学技术大学生命科学与医学部合肥230026 中国科学院生物物理研究所核酸生物学重点实验室北京100101 中国科学院大学北京100049 北京师范大学生命科学学院北京100875

SAC-1/h SAC1(suppressor of actin mutations 1-like protein,SAC1)是一种广泛表达于多种组织的PI4P磷酸酶,也是一种对线虫发育的各个阶段都至关重要的PI(phosphoinositide)信号调控因子.为了研究其在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)精子发生过程中的具体功能,采用生长素诱导蛋白降解(auxin-induced protein degradation,AID)的方法,在精子发育过程中对SAC-1进行时间-空间降解.本研究首先利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在SAC-1 N端融合Degron-GFP标签,使用生殖腺特异性表达启动子sun-1驱动植物特有的F-box蛋白TIR1表达,构建SAC-1蛋白在生殖腺组织特异性降解的AID虫系.然后通过精子体外激活以及Mito Tracker标记的精子体内运动实验,检测精子的运动能力,分析精子激活时胞内膜细胞器(membranous organelles,MOs)与质膜的融合情况以及线虫的生育能力.结果表明,SAC-1在生殖腺细胞的特异性降解影响精子激活的运动能力,具体表现为激活精子的伪足变短,融合的MOs数量降低,线虫育性明显下降.综上,本研究成功构建了生长素诱导的SAC-1组织特异性降解虫系,并表明SAC-1在生殖腺细胞的缺失影响精子细胞的激活及运动,为进一步研究包括SAC-1在内的广泛性表达的多功能蛋白在精子发生过程中的调控功能提供了新的思路和技术.

关键词： AID技术组织特异性敲除 SAC-1 精子活化秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)

LiGHRKO雄性小鼠非酒精性脂肪肝模型的建立及表型分析

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LiGHRKO雄性小鼠非酒精性脂肪肝模型的建立及表型分析

作者：姜美君延边大学

学位级别：硕士

非酒精性脂肪肝(NAFLD),是一种除酒精和其他明确的肝损伤因素之外,引起肝实质细胞内的脂肪变性临床病理综合征。研究表明,血液中生长激素(GH)含量较低或肝GH信号的通路受损与NAFLD发生相关;在肝内,GH对生长代谢的调控作用主要通过生长... 详细信息

非酒精性脂肪肝(NAFLD),是一种除酒精和其他明确的肝损伤因素之外,引起肝实质细胞内的脂肪变性临床病理综合征。研究表明,血液中生长激素(GH)含量较低或肝GH信号的通路受损与NAFLD发生相关;在肝内,GH对生长代谢的调控作用主要通过生长激素受体介导刺激合成胰岛素样生长因子(IGF-1)来实现;血液中低水平IGF-1与脂肪肝相关,并且IGF-1水平越低,肝脏脂肪堆积越重。本文将利用肝脏特异性敲除生长激素受体(LiGHRKO)雄性小鼠来讨论GH/IGF-1轴与NAFLD之间的联系,并比较其与高脂饲料造模小鼠的表型异同。这为深入研究NAFLD发病机理及IGF-1对脂肪肝发生发展的影响提供了优秀疾病动物模型。通过葡萄糖耐量和胰岛素耐量检测,解剖取材并进行血清学与病理学检测,结果显示如下:***和RNA水平双重验证LiGHRKO雄性小鼠Ghr基因已在肝脏内成功敲除。8周龄LiGHRKO雄性小鼠较对照组GH升高了将近4倍,IGF-1水平降低,幅度约为90%。***雄性小鼠体重低于对照组和高脂组,肉眼观察肝脏重量与体积增大,其肝指数明显高于对照组并与高脂组相近,其他脏器重量无明显变化。LiGHRKO雄性小鼠和高脂组小鼠血清中的T-CHO、VLDL、ALT/AST、TNF-α的水平均明显升高(P<0.05)。LiGHRKO雄性小鼠和高脂组小鼠均出现糖耐量减退、胰岛素抵抗和糖代谢异常。LiGHRKO雄性小鼠和高脂组小鼠均发生线粒体活性氧升高,线粒体功能异常。3.病理学(H&E)检测发现LiGHKO雄性小鼠和高脂组小鼠均有肝细胞肿大,细胞质内有脂滴形成。油红O染色发现,LiGHRKO雄性小鼠和高脂组小鼠的肝脏均可见大面积的红色脂滴,脂肪沉积明显。综上所述,LiGHRKO雄性小鼠呈现糖脂代谢稳态失衡,胰岛素抵抗,肝脏脂肪堆积,线粒体功能紊乱等非酒精性脂肪肝相关典型表型;该造模方法达到了高脂饲养造模的效果。

关键词：生长激素受体组织特异性敲除非酒精性脂肪肝动物模型

利用CRISPR/Cas9技术构建ALK7^(LoxP/LoxP)小鼠品系

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中国动脉硬化杂志 2019年第1期27卷 69-74页

作者：赵强刘灯泉李毅辉戴红艳唐梦熊管军青岛大学附属青岛市市立医院心内科山东省青岛市266000 山东大学齐鲁医院重症医学科山东省济南市250012 山东大学齐鲁医院急诊科山东省济南市250012

目的利用CRISPR/Cas9技术将LoxP序列靶向导入小鼠活化素受体样激酶7(ALK7)基因,构建ALK7LoxP/LoxP小鼠,与组织特异性Cre小鼠杂交,获得时空特异性ALK7基因敲除小鼠,为研究ALK7在特定时间特定组织中的功能奠定基础。方法利用CRISPR/Cas9... 详细信息

目的利用CRISPR/Cas9技术将LoxP序列靶向导入小鼠活化素受体样激酶7(ALK7)基因,构建ALK7LoxP/LoxP小鼠,与组织特异性Cre小鼠杂交,获得时空特异性ALK7基因敲除小鼠,为研究ALK7在特定时间特定组织中的功能奠定基础。方法利用CRISPR/Cas9技术编辑小鼠ALK7基因:设计合成识别ALK7基因外显子4-6上下游非编码序列的sg RNA。设计并合成LoxP-ALK7-LoxP打靶载体,测序正确后,显微注射法将体外合成的sg RNA、Cas9 m RNA和打靶载体注射到小鼠受精卵,移植受精卵至假孕小鼠输卵管代孕。获得仔鼠后通过PCR、Southern blot鉴定子代小鼠基因型,实时荧光定量PCR、Western blot检测ALK7转录表达水平。结果获得了含有目的基因的打靶阳性小鼠,并且插入的LoxP序列不影响ALK7的转录表达水平。结论利用CRISPR/Cas9技术成功将LoxP序列靶向引入小鼠ALK7基因,成功构建ALK7LoxP/LoxP小鼠品系,为进一步构建组织特异性ALK7基因敲除小鼠模型奠定了基础。

关键词： CRISPR/Cas9 活化素受体样激酶7基因 LoxP序列组织特异性敲除