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纳米金棒应用于肝吸虫血清循环抗原检测的研究

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大理大学学报 2023年第10期8卷 27-33页

作者：陈丽萍廉晓丽蔡子涵李倩欧阳天昭杨毅梅大理大学基础医学院云南大理671000 山西医科大学晋祠学院太原030000 大理大学临床医学院云南大理671000 大理大学第一附属医院云南大理671000

目的:研究纳米金棒对肝吸虫病早期及低虫荷的检测效应。方法:纳米金棒标记不同浓度巯基化的肝吸虫特异性IgG抗体,用紫外分光光度计扫描纳米金棒吸收峰,观察吸收峰位移大小,优选出最佳标记浓度;用纳米金棒标记最佳浓度抗体,检测不同感染... 详细信息

目的:研究纳米金棒对肝吸虫病早期及低虫荷的检测效应。方法:纳米金棒标记不同浓度巯基化的肝吸虫特异性IgG抗体,用紫外分光光度计扫描纳米金棒吸收峰,观察吸收峰位移大小,优选出最佳标记浓度;用纳米金棒标记最佳浓度抗体,检测不同感染度、不同感染时间及不同稀释度的大鼠血清循环抗原。结果:纳米金棒标记20μg/mL抗体时,吸收峰位移最大为20.0 nm;肝吸虫特异性IgG抗体纳米金棒可检出50、100、200条囊蚴感染后3、10、17、31 d的血清循环抗原及稀释度为1︰400的血清循环抗原。结论:肝吸虫特异性IgG抗体纳米金棒对肝吸虫病早期及低虫荷的检测具有明显优势。

关键词：纳米金棒肝吸虫循环抗原特异性IgG抗体检测

纳米金棒标记旋毛虫期抗原筛选及血清学检测研究

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纳米金棒标记旋毛虫期抗原筛选及血清学检测研究

作者：朱逢龙大理大学

学位级别：硕士

目的成功制备表面标记旋毛虫成虫、新生幼虫、囊包幼虫的虫期粗抗原和纯化抗原的纳米金棒,筛选出纳米金棒标记旋毛虫病的优势检测抗原及最适包被浓度,证实纳米金棒标记旋毛虫成虫纯化抗原的检测方法,能够为旋毛虫病的早期灵敏检测奠定... 详细信息

目的成功制备表面标记旋毛虫成虫、新生幼虫、囊包幼虫的虫期粗抗原和纯化抗原的纳米金棒,筛选出纳米金棒标记旋毛虫病的优势检测抗原及最适包被浓度,证实纳米金棒标记旋毛虫成虫纯化抗原的检测方法,能够为旋毛虫病的早期灵敏检测奠定实验基础。方法1.通过感染动物的方法,建立旋毛虫病的模型,收集旋毛虫成虫、新生幼虫、囊包幼虫的虫期粗抗原和纯化抗原及旋毛虫感染小鼠血清。2.巯基化旋毛虫成虫、新生幼虫、囊包幼虫的虫期粗抗原和纯化抗原,分别与纳米金棒聚合,通过紫外分光光度计扫描纳米金棒表面纵向等离子共振吸收峰的红峰移位变化,筛选出相应抗原的最佳包被浓度。3.将纳米金棒标记旋毛虫三个虫期的粗抗原和纯化抗原分别对不同时间、不同感染程度及不同稀释度阳性血清抗体检测结果作比较,筛选出旋毛虫标记纳米金棒的优势检测抗原;同时将检测结果与ELISA法对比,研究纳米金棒标记旋毛虫最佳检测抗原的早期灵敏性。结果1.成功建立旋毛虫病动物模型,并获得旋毛虫成虫、新生幼虫和囊包幼虫的虫期粗抗原和纯化抗原。2.制备了旋毛虫成虫、新生幼虫、囊包幼虫的虫期粗抗原和纯化抗原包被的纳米金棒,筛选出各个抗原最大的红峰移位及相应的最佳包被浓度:成虫粗抗原最大红峰移位为8nm,对应的最佳包被浓度为40ug/ml;新生幼虫粗抗原最大红峰移位为11nm,对应的最佳包被浓度为40ug/ml;囊包幼虫粗抗原最大红峰移位为11nm,对应的最佳包被浓度为30ug/ml;成虫纯化抗原72KD包被前后最大红峰移位为29nm,对应的最佳包被浓度为30ug/ml;旋毛虫新生幼虫纯化抗原260KD包被前后最大红峰移位为20nm,对应的最佳包被浓度为30ug/ml;旋毛虫囊包幼虫纯化抗原28KD包被前后最大红峰移位为21nm,对应的最佳包被浓度为20ug/ml。3.旋毛虫成虫、新生幼虫和囊包幼虫的虫期粗抗原包被的纳米金棒检测不同时间和不同感染程度的血清抗体最大红峰移位为9nm,最小红峰移位为0。旋毛虫成虫、新生幼虫和囊包幼虫的虫期纯化抗原包被的纳米金棒检测不同时间和不同感染程度的血清抗体最大红峰移位为49nm,最小红峰移位为9nm。结果以成虫纯化抗原包被的纳米金棒检测效果为最佳,筛选出成虫纯化抗原作为旋毛虫病的优势检测抗原。对比ELISA法检测结果:纳米金棒标记的成虫纯化抗原在检测旋毛虫感染轻度、中度的血清抗体较ELISA法提前8d;纳米金棒标记的成虫纯化抗原在检测旋毛虫阳性血清抗体的最低稀释度为1:800,也远低于ELISA法能检测的阳性血清最低稀释度1:600。结论成功制备旋毛虫成虫、新生幼虫和囊包幼虫的虫期粗抗原和纯化抗原包被的纳米金棒,筛选出旋毛虫三个虫期抗原的最佳包被浓度。优选出旋毛虫成虫纯化抗原72KD为最佳检测抗原,其最适包被浓度为30ug/ml。纳米金棒标记旋毛虫成虫纯化抗原检测血清抗体结果较ELISA法,检测时间更早、灵敏性更高,为丰富旋毛虫病的检测方法提供新的技术思路。

关键词：纳米金棒旋毛虫病旋毛虫抗原检验

纳米金棒诱导A549细胞产生自噬的机制研究

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电子显微学报 2017年第3期36卷 279-285页

作者：吕园园王飞飞汤莹沈亚峰范晓燕袁青宁雷长海杨勇骥第二军医大学基础医学部生物物理学教研室上海200433

纳米金棒(AuNRs)具有众多独特的属性,已广泛运用于生物医学领域,但其是否具有潜在的生物危害尚有争议。作者运用了激光扫描共聚焦显微镜技术、western blotting技术和其他分子生物学方法从细胞氧化应激的角度探讨了AuNRs诱导A549细胞产... 详细信息

纳米金棒(AuNRs)具有众多独特的属性,已广泛运用于生物医学领域,但其是否具有潜在的生物危害尚有争议。作者运用了激光扫描共聚焦显微镜技术、western blotting技术和其他分子生物学方法从细胞氧化应激的角度探讨了AuNRs诱导A549细胞产生自噬的分子机制。研究结果表明,4μg·m L^(-1)的AuNRs处理6 h能够诱导A549细胞自噬标志蛋白LC3-II表达增加,LC3蛋白从细胞核转移至细胞质并形成自噬小泡。进一步研究发现,AuNRs能够降低A549细胞线粒体膜电位、ATP含量、UCP2蛋白表达水平以及细胞抗氧化能力并导致活性氧蓄积,后者可能最终引起细胞产生自噬。而10 mmol·L^(-1)抗氧化剂NAC能够逆转上述线粒体及细胞功能的改变,并抑制自噬的发生。这一研究为深入认识其生物危害及可能机制提供了有力的实验证据。

关键词：纳米金棒自噬氧化应激 ROS LC3 线粒体

纳米金棒的优化聚合及应用于血吸虫病检测的基础研究

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纳米金棒的优化聚合及应用于血吸虫病检测的基础研究

作者：李家萌大理大学

学位级别：硕士

目的纳米技术目前已成为多种学科研究的热点问题和前沿方向,纳米金作为一种性能优良的纳米材料在疾病的早期诊断、检测以及治疗方面得到广泛研究。本研究对纳米金棒的制备条件进行了优化,选择最具有所需光学性质的纳米金棒,并成功将其... 详细信息

目的纳米技术目前已成为多种学科研究的热点问题和前沿方向,纳米金作为一种性能优良的纳米材料在疾病的早期诊断、检测以及治疗方面得到广泛研究。本研究对纳米金棒的制备条件进行了优化,选择最具有所需光学性质的纳米金棒,并成功将其功能化,制备了实验室条件下可针对日本血吸虫病检测的高特异性、敏感性的纳米金生物探针。方法通过种子介导的生长法聚合纳米金棒,通过对增长媒质中不同成分的比例、反应时间、温度等控制,系统的研究纳米金棒最佳的聚合条件,最大程度的提高单个纳米颗粒的生物功能,聚合具有所需的形貌和波长可控的纳米金棒。制备日本血吸虫尾蚴和成虫可溶性抗原,并将抗原与纳米金棒结合,构建NanoSPR生物探针,将NanoSPR生物探针功能化,通过表面等离子共振峰的LSPR峰变化来探索抗原包被的最佳浓度。将功能化的NanoSPR生物探针检测不同浓度梯度的感染日本血吸虫阳性血清抗体,并与ELISA检测结果做对照分析研究,探索日本血吸虫NanoSPR生物芯片的高特异性。将功能化的NanoSPR生物探针检测感染日本血吸虫前1-8周的兔血清抗体,并与ELISA检测结果做对照分析研究,探索日本血吸虫NanoSPR生物芯片的高敏感性。结果通过对GNRs在制备过程中还原剂、活性剂、温度等条件的优化,系统的研究了GNRs的最佳实验制备条件。在增长媒质中CTAB的最佳浓度为0.095mol/L,AA的最佳浓度为0.640m mol/L,AgNO3的最佳浓度为72μmol/L,种子的最佳生长温度为28°C,种子溶液在增长媒质中生长12h基本趋于稳定,各项指标基本不再发生变化。在成功制备NanoSPR生物探针后,同过对NanoSPR生物探针不同的实验分析得出:包被浓度为20μg/m L时包被前后LSPR峰出现了最大程度的红移达到18nm且峰形正常,确定为最佳包被浓度;对比包被两种不同抗原的GNRs的检测结果,其中NanoSPR-SCA生物探针相对于NanoSPR-AWA的识别日本血吸虫感染早期的血清具有一定的优势;相比于ELISA检测结果的对比发现,通过纳米金标记对抗原抗体反应产生的放大作用,使NanoSPR-AWA生物探针对血清中血吸虫抗体的检测更具有灵敏性,最低检测限可达到稀释倍数的80倍。相比于传统的ELISA检测法,NanoSPR生物探针针对日本血吸虫感染早期的血清体现出了更强的识别能力。结论利用种子生长法通过探索最佳CTAB、AgNO3、AA等试剂浓度和影响金棒制备因素的实验条件,制备了长径比较高、等离子体共振峰位置和强度可有效调控的纳米金棒。并对基于纳米金标记的免疫传感器NanoSPR生物探针进行了实验室阶段的基础研究,证实基于纳米金标记的传感器是一种可以针对日本血吸虫病具有更高特异性,更灵敏的检测方法和工具,并为丰富日本血吸虫病的检测方法提供了技术支持的新思路。

关键词：纳米金棒血吸虫病血清学检测标记技术

纳米金棒标记旋毛虫诊断抗原的筛选及应用于血清学诊断的研究

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纳米金棒标记旋毛虫诊断抗原的筛选及应用于血清学诊断的研究

作者：曹颖大理大学

学位级别：硕士

目的:利用纳米金棒具有独特的光学特性、合成稳定分散均匀、表面活性很高,易与其他原子结合,能够敏感、高效的检测待测样品的特点,制备不同径长比纳米金棒溶液,确定制备表面等离子共振波长最大的纳米金棒生长液的浓度和量。筛选出纳米... 详细信息

目的:利用纳米金棒具有独特的光学特性、合成稳定分散均匀、表面活性很高,易与其他原子结合,能够敏感、高效的检测待测样品的特点,制备不同径长比纳米金棒溶液,确定制备表面等离子共振波长最大的纳米金棒生长液的浓度和量。筛选出纳米金棒表面标记旋毛虫诊断的最佳抗原及最适宜浓度,使功能化的纳米金棒标记技术的灵敏性明显提高,可应用于旋毛虫感染血清抗体的早期或低度感染检测,为旋毛虫病早期快速检测提供新技术奠定实验基础。方法:1.改变生长液中十六烷基三甲基溴化铵(CTAB,cetyl trimethy ammonium bromide)、抗坏血酸(AA,ascorbic acid)、硝酸银(AgNO3,silver nitrate)的浓度和剂量,制备不同表面等离子共振吸收峰的纳米金棒,紫外分光光度计扫描纳米金棒表面等离子共振波长。2.胃蛋白酶消化法制备旋毛虫肌幼虫粗抗原、RPMI-1640培养法制备排泄分泌抗原,粗抗原、排泄分泌抗原表面标记纳米金棒,紫外分光扫描表面等离子共振波长,对比表面等离子共振吸收峰红峰移位,筛选纳米金棒表面标记的最佳抗原和最适应浓度。3.纳米金棒表面标记旋毛虫肌幼虫排泄分泌抗原分别检测旋毛虫感染小鼠不同稀释度、不同时间、不同感染程度的血清抗体,与小鼠血清抗体ELISA检测试剂盒检测结果进行对比,评价纳米金棒标记技术效果。结果:1.成功的利用金晶种子生长方法制备了不同表面等离子共振吸收峰的纳米金棒,生长液中CTAB量为11.875 mL浓度为0.2 M、抗坏血酸量为160μL浓度为100 mM、硝酸银量为150μL浓度为10 mmol/L、金晶种子液为108μL,纳米金棒紫外分光光度计吸收光谱值最大,径长比最大,溶液均匀稳定。2.成功的在纳米金棒表面标记不同浓度旋毛虫肌幼虫粗抗原和排泄分泌抗原,紫外分光光度计光谱扫描结果显示表面等离子共振吸收峰红峰移位最大值分别为8 nm和87 nm。3.纳米金棒标记法检测旋毛虫感染小鼠阳性血清抗体最大稀释度为1:800,血清抗体阳性最早出现在感染后第5天,最低感染量为50条旋毛虫感染。小鼠血清抗体ELISA试剂盒检测旋毛虫感染小鼠阳性血清最大稀释为1:700,血清抗体阳性最早出现在感染后第8天,最低感染量为100条旋毛虫感染。结论:1.成功的利用金晶种子生长法制备了不同径长比且能够作为抗原标记功能的纳米金棒。2.纳米金棒表面标记优先筛选最佳抗原为旋毛虫肌幼虫排泄分泌抗原,其最适宜浓度为20μg/mL。3.纳米金棒标记技术能够用于旋毛虫血清学检测,较小鼠血清抗体ELISA检测试剂盒检测抗体稀释度高、时间早、感染程度低,能够为旋毛虫病感染早期及低感染度检测提供新技术。

关键词：纳米金棒生物标记技术旋毛虫血清学诊断肌幼虫粗抗原肌幼虫排泄分泌抗原

致病性大肠埃希菌多克隆抗体IgG纳米金棒检测全菌抗原的基础研究

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致病性大肠埃希菌多克隆抗体IgG纳米金棒检测全菌抗原的基础研究

作者：蔡子涵大理大学

学位级别：硕士

目的挑选致病性大肠埃希菌中致病性较强的大肠埃希菌O157:H7为本实验的目的菌株,制备高纯度的大肠埃希菌O157:H7多克隆抗体IgG,筛选纳米金棒标记抗体的最适浓度,研究纳米金棒标记大肠埃希菌O157:H7多克隆抗体IgG检测大肠埃希菌O157:H7... 详细信息

目的挑选致病性大肠埃希菌中致病性较强的大肠埃希菌O157:H7为本实验的目的菌株,制备高纯度的大肠埃希菌O157:H7多克隆抗体IgG,筛选纳米金棒标记抗体的最适浓度,研究纳米金棒标记大肠埃希菌O157:H7多克隆抗体IgG检测大肠埃希菌O157:H7的全菌抗原的可行性,为大肠埃希菌O157:H7敏感、特异检测奠定实验基础,为进一步临床检测病原性微生物提供科学依据。方法1.制备大肠埃希菌O157:H7的全菌抗原免疫家兔,获得抗大肠埃希菌O157:H7血清抗体,ELISA间接法检测抗体效价以及特异性,亲和层析法纯化所得的抗血清,SDS-PAGE鉴定纯化的效果。2.金晶种子法生长法聚合纳米金棒,标记不同浓度巯基化的大肠埃希菌O157:H7多克隆抗体IgG,观察紫外分光光度计扫描纳米金棒表面纵向等离子共振吸收峰的红峰移位的变化情况,筛选纳米金棒标记抗体的最佳浓度。3.纳米金棒标记最佳浓度的抗体检测不同浓度的大肠埃希菌O157:H7的全菌抗原,观察紫外分光光度计扫描纳米金棒表面纵向等离子共振吸收峰的红峰移位的变化情况,筛选纳米金棒标记法检测大肠埃希菌O157:H7的最佳抗原浓度;纳米金棒标记最佳浓度的抗体检测常见致病菌的最佳检测抗原浓度的全菌抗原验证其特异性。4.纳米金棒标记法检测大肠埃希菌O157:H7的全菌抗原的结果与免疫经典实验ELISA作比较,探索纳米金棒标记最佳浓度的大肠埃希菌O157:H7多克隆抗体IgG的检测灵敏度。结果1.成功制备大肠埃希菌O157:H7的全菌抗原,获得高效价、高纯度的大肠埃希菌O157:H7多克隆抗体IgG。2.纳米金棒标记浓度为50μg/ml的大肠埃希菌O157:H7多克隆抗体IgG抗体时的表面纵向等离子吸收峰的红峰移位最大为15.78 nm,此时的纳米金棒波长图和峰型均正常,确定50μg/ml为标记抗体的最佳浓度。3.纳米金棒标记大肠埃希菌O157:H7多克隆抗体IgG检测浓度为10 cfu/ml的大肠埃希菌O157:H7的全菌抗原时,红峰移位为0.92 nm,检测结果为阴性;检测浓度为10～10cfu/ml的大肠埃希菌O157:H7的全菌抗原时,出现明显的红峰移位,最大红峰移位为10.37 nm,最小的红峰移位为2.54 nm,检测结果为阳性,最低检出限为10 cfu/ml。当检测浓度为10cfu/ml时,红峰移位最大,检测该浓度抗原时,抗原抗体结合最佳,确定10cfu/ml的全菌抗原为最佳检测抗原浓度。纳米金棒标记大肠埃希菌O157:H7多克隆抗体IgG检测浓度为10 cfu/ml的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌、鲍氏志贺菌以及肠炎沙门菌的全菌抗原时,红峰移位分别为0.84 nm,-2.98 nm,0.91 nm,1.46 nm,1.59 nm。所有检测的红峰位移均≤2 nm,检测结果为阴性。4.ELISA方法检测大肠埃希菌O157:H7的全菌抗原的最低浓度为10cfu/ml;通过文献数据分析得出胶体金检测大肠埃希菌O157:H7的最低浓度为1.14x10cfu/ml,与纳米金棒标记法对比,纳米金棒标记法检测大肠埃希菌O157:H7的敏感性明显优于ELISA法和胶体金检测方法。结论成功制备长径比稳定的纳米金棒。筛选出纳米金棒标记多克隆抗体IgG的最适浓度为50μg/ml的高敏感性功能化纳米金棒。构建纳米金棒标记大肠埃希菌O157:H7多克隆抗体IgG检测大肠埃希菌O157:H7的全菌抗原的方法。通过ELISA法和胶体金检测方法比较,具有更高的灵敏度,具有操作简单、检测用时短,成本低的优势,为大肠埃希菌O157:H7感染的敏感性检测提供新的技术支持。

关键词：纳米金棒大肠埃希菌O157:H7 多克隆抗体IgG 生物标记技术纳米金棒标记法

纳米金棒-MUC1适配体复合物的构建及其靶向识别研究

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纳米金棒-MUC1适配体复合物的构建及其靶向识别研究

作者：刘栋广东药科大学

学位级别：硕士

【研究背景】肺癌是危害人类生命健康的常见疾病,其发病率和死亡率高居常见肿瘤之首。大部分肺癌患者因症状不明显,发现时多已进展至晚期,传统放疗、化疗等手段治疗效果不佳,新兴的靶向药物及免疫调定点阻滞剂在肺癌患者治疗中表现出持... 详细信息

【研究背景】肺癌是危害人类生命健康的常见疾病,其发病率和死亡率高居常见肿瘤之首。大部分肺癌患者因症状不明显,发现时多已进展至晚期,传统放疗、化疗等手段治疗效果不佳,新兴的靶向药物及免疫调定点阻滞剂在肺癌患者治疗中表现出持续获益,但均存在其局限性,在肺癌的诊断及治疗领域要有新的突破需寻求新的靶向治疗策略。纳米金棒(AuNRs)具有独特的生物相容性、表面修饰和功能化、高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention,EPR)、表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)、光热转换效应等理化及生物性质,在肿瘤诊断和治疗领域展示出巨大应用前景,通常将表面修饰的AuNRs结合靶向分子构建具有主动靶向功能的AuNRs复合载体广泛应用于分子成像、靶向载药、放疗增敏、光热治疗等肿瘤诊断及治疗领域。核酸适配体是一种通过指数级富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)从随机单链核酸序列库中逐层筛选扩增出的能特异性与靶标结合的小片段DNA或RNA,与传统抗体相比,具有高亲和性、免疫原性弱、易于大规模合成、易于体外修饰、易于穿透肿瘤组织等性质,成为理想的靶标分子。黏蛋白-1(Mucin-1,MUC1)是一种分布在呼吸道、腺体导管、胃肠道等上皮细胞表面的高度糖基化黏蛋白,研究已表明它与肿瘤的发生、肿瘤细胞生长、肿瘤细胞迁移等过程密切相关,发生癌变时在细胞表面异常高表达,且暴露其核心肽上的相关抗原表位,使其成为一种广谱靶标分子。为充分发挥AuNRs和核酸适配子的高效性,可考虑通过SELEX技术筛选出能与肺癌细胞表面高表达的MUC1蛋白具有高度亲和性的MUC1适配体(MUC1-aptamer),并将MUC1适配体与表面修饰的AuNRs连接构建一种新的具有主动靶向功能的复合物,应用于肺癌的早期诊断及治疗领域的研究,探究肺癌细胞对这种复合物的摄取机制,并在此基础上进行靶向药物运载、在人体组织投射窗口予近红外激光照射等相关的靶向杀伤研究,以期为肺癌的新型靶向诊疗平台提供理论基础,为肺癌的早期诊断和治疗提供新的思路。【研究目的】1.如何通过严格控制实验条件,调节纳米金粒子纵横比以合成在525nm和近800nm波长处具有双spr峰的aunrs;2.筛选并合成能与肺癌a549细胞系表面高表达的muc1蛋白具有高度亲和的muc1-aptamer;3.在成功合成前两步目标物质基础上构建具有主动靶向功能的aunrs/muc1-aptamer复合物;4.探究所构建的新型靶向aunrs/muc1-aptamer复合物与高表达muc1蛋白的肺癌a549细胞系结合、摄取特点,对比纳米金棒被动靶向性的优势所在;5.探究给予人体组织投射窗口的近红外激光照射对靶向结合aunrs/muc1-aptamer复合物的a549细胞的特异性杀伤效应。【研究方法】1.改变agno3、ctab、抗坏血酸(ascorbicacid,aa)的浓度,调整纳米金粒子纵横比,通过金种子法诱导生长法(seed-mediatedgrowthmethods)合成在525nm和近800nm波长处具有双向spr峰的aunrs,并进一步通过紫外分光法测定验证,所得aunrs置于4℃保存备用;2.选取对muc1蛋白核心肽具有高亲和性的适配体s2.2作为目标muc1核酸适配体,并在单链muc1-aptamer的5’端修饰巯基以结合aunrs,在3’端修饰6’-fam荧光基团作为特异性结合靶细胞的检测标记,通过质谱检测验证合成目标适配体的序列正确性及纯度;3.通过纳米金棒的快速修饰法(rapidmodificationatlowph,rmlp)高效快速地将合成的巯基化muc1-aptamer修饰连接aunrs,并使用纳米金比色法、紫外分光法对所构建的aunrs/muc1-aptamer复合物的物理特性进行表征及验证;4.将所构建的aunrs/muc1-aptamer复合物分别与传代培养的肺癌a549细胞系及对照组肝癌hepg2细胞系孵育,流式细胞仪检测及荧光显微镜观察复合物与细胞的靶向结合与摄入,细胞表面荧光强度代表靶向复合物结合细胞的效率;5.利用aunrs的近紫外区吸收峰及光热转换特性,使用近红外光分别对与aunrs/muc1-aptamer复合物和aunrs孵育后的靶细胞进行照射,并使用mtt比色法检测对肿瘤细胞的杀伤效应,细胞存活率的大小与其孵育的药物毒性相关。【结果】金种子诱导生长法所合成纳米金棒通过紫外分光光度计法检测其紫外吸收波谱,在波长525nm和近800nm近红外光处可见双重等离子共振峰,即为目标所需AuNRs;将合成的巯基化MUC1-aptamer通过快速修饰法对AuNRs进行修饰,合成AuNRs/MUC1-aptamer

关键词：纳米金棒核酸适配体 MUC1蛋白肺癌靶向治疗

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纳米金棒对A549细胞毒性的机制研究

纳米金棒对A549细胞毒性的机制研究

作者：吕园园第二军医大学

学位级别：硕士

纳米金棒(Gold nanorods,AuNRs)是指尺度介于1-100nm之间的棒状纳米金颗粒,在光学特性、量子隧道效应、生物相容性、表面易修饰性和稳定性等方面具有独特的物理及化学属性,因此被认为是最具应用前景的纳米材料之一。近年来,随着纳米技... 详细信息

纳米金棒(Gold nanorods,AuNRs)是指尺度介于1-100nm之间的棒状纳米金颗粒,在光学特性、量子隧道效应、生物相容性、表面易修饰性和稳定性等方面具有独特的物理及化学属性,因此被认为是最具应用前景的纳米材料之一。近年来,随着纳米技术在生物医学领域的发展,AuNRs在细胞和动物活体成像、药物和基因传递以及多种疾病的诊断和治疗等方面的运用越来越多。然而,随着AuNRs广泛应用,人们接触AuNRs的机会日益增多,AuNRs暴露所引起的生物安全问题也受到越来越多的关注。因此,探究AuNRs对生物体可能潜在的影响及其机制是纳米金材料得到更加安全、广泛运用的基础。本研究拟首先采用不同浓度AuNRs处理A549细胞6h、12h和24h,然后通过CCK-8、LDH实验观察AuNRs对A549细胞活力、细胞膜损伤的影响。在此基础上,运用透射电镜观察AuNRs对细胞超微结构的影响,并初步判断AuNRs的细胞毒性。进一步,拟运用Western blot技术、激光扫描共聚焦显微技术和其他分子生物学方法来观察AuNRs细胞毒性是否与其通过损伤线粒体相关功能、促进氧化应激进而诱导细胞自噬有关,相关实验结果如下:一、AuNRs对A549细胞毒性的影响首先,将正常培养的A549细胞给予不同浓度AuNRs处理(0μg/ml,0.5μg/ml,1μg/ml,2μg/ml,4μg/ml),分别处理6h、12h、24h后观察其对细胞活力、细胞膜损伤和细胞超微结构的影响,实验结果如下:1.AuNRs对A549细胞活力的影响CCK-8实验结果表明,采用不同浓度AuNRs处理后,A549细胞活力呈剂量、时间依赖性降低。提示,AuNRs细胞毒性呈剂量、时间依赖性增加。2.AuNRs对A549细胞膜损伤的影响LDH实验结果表明,采用不同浓度AuNRs处理后,A549细胞呈现LDH渗漏且上清LDH呈剂量、时间依赖性增加。提示,AuNRs细胞毒性呈剂量、时间依赖性增加,AuNRs作用的浓度越高、时间越长,对细胞的毒性越大。3.AuNRs对A549细胞超微结构的影响透射电镜研究结果表明,AuNRs能够进入A549细胞,并以单个颗粒或聚集体的形式存在于细胞质和部分膜囊泡中,而细胞核未观察到AuNRs。此外,细胞中部分线粒体呈不同程度肿胀,并且自噬小体数目较对照组显著增加。二、aunrs对a549细胞自噬的影响研究发现,自噬是纳米材料细胞毒性的重要机制之一。那么aunrs对a549细胞毒性是否与自噬有关呢?我们进行以下研究,实验结果如下:1.aunrs对a549细胞自噬标志蛋白lc3的影响激光扫描共聚焦显微镜观察结果表明,不同浓度aunrs处理a549细胞6h后,lc3表达呈剂量依赖性增加。其中,con组lc3主要表达并集中于细胞核,而随着aunrs浓度的增加,lc3表达逐渐从细胞核转移到细胞质,细胞核lc3表达逐步减少并呈空泡化。再将a549细胞给予2μg/ml的aunrs分别处理6h、12h和24h并观察lc3表达情况,结果表明,a549细胞lc3表达呈时间依赖性增加。con组lc3主要表达并集中于细胞核,而随着aunrs暴露时间的增加,lc3表达逐渐从细胞核转移到细胞质,细胞核lc3表达逐步减少并呈空泡化。2.aunrs对a549细胞自噬相关蛋白的影响westernblot结果表明,不同浓度aunrs处理a549细胞6h后,lc3-ii、atg4、atg16和beclin1蛋白表达显着增加,而自噬底物蛋白p62表达水平显著降低。提示,aunrs诱导a549细胞发生自噬呈剂量、时间依赖性增加。3.cq能够抑制aunrs诱导的自噬westernblot结果表明,正常培养条件下con组atg16、lc3-ii少量表达,给予cq处理后atg16、lc3-ii表达较con组显著增加,表明cq可以抑制基础水平自噬溶酶体降解。给予aunrs处理后,atg16、lc-ii表达较对照组显著增加。aunrs和cq共同处理a549细胞6h后,atg16高表达可被cq逆转,而lc3-ii表达则进一步增加。这一结果表明,cq不仅可以抑制由aunrs诱导自噬的起始,而且可以抑制自噬溶酶体降解。三、氧化应激介导aunrs诱导a549细胞产生的自噬近年来有研究发现,氧化应激是诱导细胞自噬的重要原因。那么aunrs诱导a549细胞发生自噬是否与氧化应激有关?我们的实验结果如下:1.抗氧化剂mntbap和nac能够抑制aunrs诱导的自噬westernblot结果表明,con组中lc3-ii表达水平较低,mntbap、nac处理后其表达水平轻微降低但无统计学意义。而aunrs处理6h后,lc3-ii表达显著增加,并且这一效应能被mntbap、nac所逆转。提示,mntbap、nac可以改善aunrs诱导a549细胞产生的自噬。激光扫描共聚焦显微镜研究表明,con组、nac组中lc3表达较弱且主

关键词：纳米金棒自噬氧化应激 ROS LC3 线粒体

无种子法纳米金棒的制备及其对肿瘤细胞光热治疗效应研究

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物理化学学报 2014年第7期30卷 1363-1369页

作者：王新环韩秋森李婧影杨蓉刁国旺王琛扬州大学化学化工学院江苏扬州225002 国家纳米科学中心纳米生物效应与安全性重点实验室北京100190

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采用简便快捷的无种子法一步完成了纳米金棒的制备.通过改变实验条件可以调控纳米金棒的吸收峰从可见到近红外转移.将巯基聚乙二醇(PEG-SH)置换金棒表面的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)分子,大大提高了金棒的生物相容性.制备的纳米金棒在近红外(NIR)光照射下对肿瘤细胞有很好的杀伤效果.研究结果为纳米金棒用于抗肿瘤治疗提供了实验基础.

关键词：纳米金棒等离子共振吸收生物相容性表面修饰热疗