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新型纳米水凝胶药物载体设计、合成及其抗肿瘤应用研究

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新型纳米水凝胶药物载体设计、合成及其抗肿瘤应用研究

作者：王钰南方医科大学

学位级别：硕士

随着人口老龄化的增长,全世界的癌症发病率和死亡率正在迅速增长,人们越来越重视癌症的治疗。化疗是当前癌症治疗中最常用的方法之一。但传统的化疗药物存在特异性差,全身毒性强,血液清除快,在体液中的溶解度差等问题,从而制约了化疗药... 详细信息

随着人口老龄化的增长,全世界的癌症发病率和死亡率正在迅速增长,人们越来越重视癌症的治疗。化疗是当前癌症治疗中最常用的方法之一。但传统的化疗药物存在特异性差,全身毒性强,血液清除快,在体液中的溶解度差等问题,从而制约了化疗药物对肿瘤的治疗效果。随着纳米医学的发展,将纳米粒子用作抗癌药物递送载体可以精确地靶向肿瘤组织、控制抗癌药物的释放以及降低抗癌药物的全身毒性。在本论文中,我们合成了含有环糊精单元的超分子识别组纳米水凝胶。众所周知,具有外亲水、内疏水空腔结构的环糊精可通过主客体相互作用包合与其尺寸匹配、疏水的客体分子。我们拟通过在纳米水凝胶的聚合网络中引入不同空腔单元的环糊精单元,以实现纳米水凝胶对包括亲水性及疏水性化疗药物在内的多种药物的高效负载,提高纳米水凝胶对抗癌药物的载药率及载药稳定性。在本实验中,我们验证了所制备的纳米水凝胶药物载体的性质:拥有良好的生物相容性;拥有较为普适性的载药能力;更加容易被癌细胞摄取;降低抗癌药物的毒副作用;增强抗癌药物治疗效果。为了让纳米水凝胶拥有更好的肿瘤靶向性,我们进一步将Fe3O4纳米粒子包裹于超分子识别组纳米水凝胶中,进而通过磁场调控纳米水凝胶材料在肿瘤中的空间分布。所做工作分为以下几点阐述:(1)筛选抗癌药物:使用等温滴定微量热法定量测试环糊精与抗癌药物间的分子间相互作用。筛选出能与环糊精存在较强分子间相互作用的抗癌药物。(2)实验组与对照组纳米水凝胶的合成:合成了含环糊精单元的实验组纳米水凝胶及不含环糊精单元的对照组纳米水凝胶。控制合成的两种纳米水凝胶尺寸相近,且形貌均为较为规整的球形。(3)两种纳米水凝胶的体外表征:使用盐酸阿霉素(DOX)作为负载药物,通过测试,实验组纳米水凝胶对DOX的负载率和负载稳定性均显著优于对照组纳米水凝胶。通过激光共聚焦显微镜及流式细胞仪测试,实验组纳米水凝胶更容易被4T1细胞摄取。通过CCK-8方法测试,负载DOX的实验组纳米水凝胶显示出比负载DOX的对照组纳米水凝胶更高的细胞毒性。(4)两种纳米水凝胶的体内表征:用鼠源乳腺癌细胞(4T1)建立动物肿瘤模型。通过测试两种纳米水凝胶及游离DOX的肿瘤治疗效果,实验结果表明负载DOX的实验组纳米水凝胶表现出最佳的肿瘤治疗效果,并降低了 DOX的全身毒副作用。(5)油相Fe3O4纳米粒子的合成及水相转换:合成了油相Fe3O4纳米粒子,并利用配体交换的方法,使用二巯基丁二酸对油相Fe3O4纳米粒子进行了水分散性改性。(6)磁性纳米水凝胶的体外磁场调控:在水相Fe3O4纳米粒子外包裹了含罗丹明单元的纳米水凝胶,在体外成功通过磁场控制磁性纳米水凝胶在细胞中的分布。综上所述,这种含环糊精单元的超分子识别组纳米水凝胶药物载体在抗癌药物递送领域有着良好的应用前景。

关键词：超分子作用纳米水凝胶药物递送磁靶向肿瘤治疗

纳米水凝胶Poly（NIPAm-co-Amino Acid）的制备及其与蛋白相互作用的初步研究

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纳米水凝胶Poly（NIPAm-co-Amino Acid）的制备及其与蛋白相互作...

作者：吴登宇南方医科大学

学位级别：硕士

抗体在医学诊断、新药开发、临床检测等方面具有重要的应用价值,但天然抗体价格昂贵,稳定性差,难以规模化生产,因此开发性能稳定、特异性可与天然抗体相媲美的人工模拟抗体具有重要的研究意义与价值。1.目的以N-丙烯酰基-L-氨基酸为功... 详细信息

抗体在医学诊断、新药开发、临床检测等方面具有重要的应用价值,但天然抗体价格昂贵,稳定性差,难以规模化生产,因此开发性能稳定、特异性可与天然抗体相媲美的人工模拟抗体具有重要的研究意义与价值。1.目的以N-丙烯酰基-L-氨基酸为功能单体,与N-异丙基丙烯酰胺NIPAm共聚,制备一系列疏水性、荷电性不同的纳米水凝胶Poly（NIPAm-co-Amino Acid）。同时探寻纳米水凝胶与不同蛋白的识别规律,为设计人工模拟抗体替代天然抗体提供实验依据。2.方法2.1以疏水性氨基酸（苯丙氨酸类、亮氨酸类）,带正电荷氨基酸（精氨酸类、组氨酸类）为原料,丙烯酰氯为酰化试剂,在碱性条件下合成N-丙烯酰基-L-氨基酸。2.2以N-丙烯酰基-L-氨基酸为功能单体,采用沉淀聚合法制备一系列Poly（NIPAm-co-Amino Acid）纳米水凝胶,对纳米水凝胶进行表征,考察温度、缓冲液及pH对粒径分布的影响。2.3通过5%纳米水凝胶与分子量、等电点不同的蛋白结合,探讨氨基酸的种类和蛋白荷电性、疏水性等对结合作用的影响。2.4通过5%带正电荷纳米水凝胶与人血浆蛋白结合,评价纳米水凝胶对蛋白的特异性识别能力。3.结果3.1本文合成了 1 1个N-丙烯酰基-L-氨基酸,其结构经核磁共振氢谱、碳谱、红外光谱等现代波谱技术进行了结构确证。其中N-丙烯酰基-L-苯丙氨酰胺、N-丙烯酰基-L-亮氨酰胺两个化合物经检索为未见文献报道的新化合物。3.2采用沉淀聚合法制备了 45种纳米水凝胶Poly（NIPAm-co-Amino Acid）。疏水性氨基酸、带正电荷的氨基酸功能单体的加入均能使纳米水凝胶的粒径减小;纳米水凝胶具有温敏性,温度可改变纳米水凝胶的粒径;PBS缓冲液中的盐离子可影响临界相变温度（LCST）,羧酸类纳米水凝胶受其影响最小;pH对羧酸类纳米水凝胶的粒径影响较大,对甲酯类纳米水凝胶影响较小,对酰胺类纳米水凝胶粒径几乎没有影响。3.3蛋白分子量越大,纳米水凝胶与其结合率越高;疏水性纳米水凝胶与蛋白的结合率高于带正电荷的纳米水凝胶;带正电荷纳米水凝胶与各蛋白的结合率差异明显,具有特异性。3.4精氨酸纳米水凝胶与人血浆蛋白中纤维蛋白原的结合能力最强,免疫沉淀实验验证了 5%精氨酸纳米水凝胶对纤维蛋白原有特异性识别能力。4.结论以N-丙烯酰基-L-氨基酸为功能单体,采用沉淀聚合法制备的纳米水凝胶可通过侧链与蛋白发生疏水、静电以及氢键等类似亲和配体的相互作用,其中疏水作用为主要作用力;5%精氨酸纳米水凝胶对人血浆蛋白中的纤维蛋白原有特异性识别能力,是一种性能稳定的人工模拟抗体。

关键词：氨基酸纳米水凝胶蛋白疏水作用氢键作用静电作用

N-异丙基丙烯酰胺类纳米水凝胶在生物识别中的研究进展

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功能材料 2020年第6期51卷 6044-6051,6066页

作者：康玲玲张禾蓉王哲王家伦孟子晖薛敏北京理工大学化学与化工学院北京102488

智能型纳米水凝胶是一种内部为三维网络结构且能稳定分散在水中形成胶体体系,粒径在1~1000 nm,能感知外界环境刺激,并对其进行响应的新型高分子材料。其中具有温敏性的N-异丙基丙烯酰胺类纳米水凝胶是目前水凝胶研究的热点之一,它会随... 详细信息

智能型纳米水凝胶是一种内部为三维网络结构且能稳定分散在水中形成胶体体系,粒径在1~1000 nm,能感知外界环境刺激,并对其进行响应的新型高分子材料。其中具有温敏性的N-异丙基丙烯酰胺类纳米水凝胶是目前水凝胶研究的热点之一,它会随着外界温度的改变而发生体积相转变,凭借其良好的生物相容性和灵敏的温度响应性,在给药系统、蛋白质分离、医学诊断、生物传感器、生物材料等生物医学领域受到了广泛的关注。结合本课题组近年来的相关工作,主要综述了基于N-异丙基丙烯酰胺类纳米水凝胶微球在蛋白识别、药物输送与释放、DNA分离等生物识别中的应用研究和发展前景。

关键词： N-异丙基丙烯酰胺纳米水凝胶生物识别

NIR响应、ROS生成的黑磷量子点纳米水凝胶的制备及其促进糖尿病大鼠耐药菌感染伤口愈合机制的研究

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NIR响应、ROS生成的黑磷量子点纳米水凝胶的制备及其促进糖尿病大...

作者：黄硕澄锦州医科大学

学位级别：硕士

目的制备近红外光响应产生活性氧(ROS)的抗菌黑磷量子点纳米水凝胶(BPQDs@NH),探索其抗菌活性以及在糖尿病大鼠伤口延迟愈合中的修复作用和机制。方法采用探头超声和水浴超声相结合的液相剥离法制备黑磷量子点(BPQDs),并将其封装在聚乙... 详细信息

目的制备近红外光响应产生活性氧(ROS)的抗菌黑磷量子点纳米水凝胶(BPQDs@NH),探索其抗菌活性以及在糖尿病大鼠伤口延迟愈合中的修复作用和机制。方法采用探头超声和水浴超声相结合的液相剥离法制备黑磷量子点(BPQDs),并将其封装在聚乙烯醇/海藻酸钠基质中,形成BPQDs@NH。通过透射电镜、X射线衍射谱、紫外-可见光谱和荧光发射光谱等方法对BPQDs@NH的特性、光热转化效率、体外释放性能、生物相容性等材料性质进行检测。选择耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐氨苄西林大肠杆菌(Ampr E.coli)进行抑菌环、体外抗菌率以及抗菌机制的研究。细胞实验选择不同的细胞分别进行血管形成实验,细胞增殖迁移实验。动物实验首先采用SD大鼠构建糖尿病模型,然后在模型背部做直径1.5厘米的圆形缺损并接种MRSA从而构建耐药菌感染的伤口模型。将建立好的模型随机分为六组:Blank、BPQDs、BPQDs@NH、Blank+NIR、BPQDs+NIR、BPQDs@NH+NIR,进行缺损部位大体观察,组织学观察和相关蛋白表达的检测。结果制备的BPQDs@NH具有良好的稳定性和光热转换效率,在近红外光照下射后,局部区域温度可迅速增加至55°C,同时通过产生活性氧、脂质过氧化、谷胱甘肽、三磷酸腺苷积累和细菌膜破坏在抑制MRSA方面发挥协同作用,对MRSA的有效灭菌率接近90%。此外,动物实验表明,BPQDs@NH通过降低炎症反应,调节血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)的表达,在12天后耐药菌感染的伤口的有效闭合率为95%。同时,静脉循环实验显示BPQDs具有良好的生物相容性,未观察到对大鼠主要器官的明显损伤。结论1、成功制备了具有良好的生物相容性的黑磷量子点纳米水凝胶。2、在近红外光照射下黑磷量子点水凝胶的光热效应产生的局部高温和ROS具有强大的抗菌性能。3、黑磷量子点纳米水凝胶能够促进人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移和血管生成,加速糖尿病大鼠耐药菌感染伤口的愈合。

关键词：黑磷量子点纳米水凝胶光热疗法抗菌糖尿病伤口愈合

Pyro&HDACi光化疗双模抗肿瘤前药分子及纳米水凝胶共载药体系的设计、合成及作用机制研究

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Pyro&HDACi光化疗双模抗肿瘤前药分子及纳米水凝胶共载药体系的设...

作者：侯蕾河北北方学院

学位级别：硕士

光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)作为一种新型抗肿瘤疗法,因其较好的安全性、选择性和与其他疗法联合应用的兼容性,受到了越来越多的关注。PDT虽然在临床上具有良好的应用,但仍存在一些问题,如PDT后肿瘤存在复发和转移的现象。现... 详细信息

光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)作为一种新型抗肿瘤疗法,因其较好的安全性、选择性和与其他疗法联合应用的兼容性,受到了越来越多的关注。PDT虽然在临床上具有良好的应用,但仍存在一些问题,如PDT后肿瘤存在复发和转移的现象。现有研究表明,PDT后肿瘤组织中组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)活性增加,组蛋白乙酰化水平升高,抑制抑瘤基因的表达,是促进肿瘤细胞增殖、复发和转移的主要原因之一。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors,HDACis)是一类有针对性的抗癌药物,可通过降低HDAC的活性,激活抑瘤基因表达,发挥抗肿瘤的作用。为降低PDT后肿瘤的复发和转移的可能,可通过光敏剂与HDACis联用,实现两者抗肿瘤机制的互补,发挥两者协同增效的作用。本课题中我们采用前药设计和分子拼接策略将光敏剂-焦脱镁叶绿酸a(Pyropheophorbide a,Pyro)与HDACis-辛二酰胺异羟肟酸(vorinostat,SAHA)和西达本胺(Chidamide,CDM)分别进行化学偶联,设计合成系列光化疗双模抗肿瘤前药分子,以期达到协同增效的作用并对其进行抗肿瘤活性的评价;并采用现代药剂学手段,设计合成牛血清白蛋白纳米水凝胶共载药体系(Pyropheophorbide a and Vorinostat-bound BSA Nano Hydrogel,PVBN),实现两者的联合用药,发挥水凝胶载药量大,生物相容性好的特点。因此本研究分为双模抗肿瘤前药分子的合成及体内外抗肿瘤活性评价和牛血清白蛋白纳米水凝胶共载药体系的合成、表征及体内外抗肿瘤活性评价两部分。一、双模抗肿瘤前药分子的合成及体内外抗肿瘤活性评价该部分采用前药设计和分子拼接策略,借助酯键和酰胺键将Pyro与SAHA、CDM分别进行化学偶联,设计成光化疗双模抗肿瘤前药分子,共合成6个目标化合物。通过核磁氢谱、碳谱和高分辨质谱对目标化合物进行表征,证明目标化合物合成成功。用CCK-8法测定目标化合物的细胞毒性,结果表明化合物4具有最强的光毒性和暗毒性,优于上市光敏剂-Talaporfin和HDACi-SAHA,以其进行后续研究。在细胞水平上通过细胞摄取、亚细胞定位、活性氧水平的测定、细胞凋亡、细胞划痕和western blot实验评估化合物4的抗肿瘤活性。结果表明,与Talaporfin相比,化合物4更容易进入细胞,可定位于线粒体和溶酶体等细胞器;显著提高细胞内ROS的水平,诱导细胞凋亡和坏死;机制研究表明,该化合物可通过抑制细胞迁移和上调Acetyl-H3蛋白的表达水平发挥HDACis的作用。在动物水平利用黑色素瘤荷瘤小鼠模型评估化合物4的抗肿瘤活性。结果表明化合物4与Talaporfin,Pyro,SAHA相比,抗肿瘤效果明显提高,并可有效抑制黑色素瘤的转移。上述研究表明,化合物4是潜在的PDT和化疗协同抗肿瘤的前药分子。二、牛血清白蛋白纳米水凝胶共载药体系的合成、表征及其体内外抗肿瘤活性评价水凝胶作为新型纳米药物载体具有刺激性小、载药量大等优点,我们利用生物相容性好的牛血清白蛋白通过化学交联的方式设计合成了一种牛血清白蛋白纳米水凝胶共载药体系(PVBN)。借助核磁氢谱、透射电镜和马尔文粒径仪对其进行表征,结果表明成功合成了PVBN,其形貌呈大小不一的球形,粒径约为(136.8±9.9)nm。药物释放实验证明,PVBN中SAHA和Pyro的载药量分别为3.83%和4.90%,在pH=7.4的缓冲溶液中36 h达到最大释放。利用细胞毒性、细胞摄取、ROS水平的测定、细胞凋亡、细胞划痕和western blot实验评估了PVBN的体外抗肿瘤活性。结果表明,与游离的Pyro和SAHA相比,PVBN的光毒性和暗毒性较好,也更容易被肿瘤细胞摄取,可提高细胞内ROS的水平,并增强了诱导肿瘤细胞凋亡和坏死的能力,能够抑制肿瘤细胞迁移并上调Acetly-H3蛋白的表达水平。荷瘤小鼠体内抗肿瘤活性评价表明,与游离的Pyro和SAHA相比,PVBN体现出了更好的体内抗黑色素瘤活性,并能明显抑制肿瘤细胞转移和侵袭。上述结果表明,共载药体系PVBN可以发挥光敏剂与HDACis协同增效作用,是一种可行的光化疗一体化给药策略。综上所述,本研究成功合成了系列光化疗双模抗肿瘤前药分子和牛血清白蛋白纳米水凝胶共载药体系(PVBN)。细胞活性评价筛选出在合成的系列前药分子中通过酯键直接连接的分子化合物4具有最好的抗肿瘤作用,体内外抗肿瘤活性研究表明,化合物4和PVBN均具有光疗和化疗的双重作用,降低了肿瘤的复发和转移,发挥协同增效的作用,为临床上光化疗联合用药和抑制PDT后肿瘤复发和转移提供新的研究思路和研究基础。

关键词：光动力治疗焦脱镁叶绿酸a 组蛋白去乙酰化酶抑制剂 SAHA 纳米水凝胶牛血清白蛋白

聚甲基丙烯酸纳米水凝胶的水相合成及其磁性功能化

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高分子学报 2016年第8期26卷 1072-1078页

作者：顾文娟陆亚明张幼维赵炯心纤维材料改性国家重点实验室东华大学材料学院上海201620

利用十二烷基硫酸钠/吐温20复配表面活性剂和原位生成的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)种子乳胶,发展了一种可在全水相中"绿色"合成较高浓度的聚甲基丙烯酸(PMAA)纳米水凝胶的新方法.以PMAA纳米水凝胶为前驱体,采用原位氧化沉淀法制备了磁性PMA... 详细信息

利用十二烷基硫酸钠/吐温20复配表面活性剂和原位生成的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)种子乳胶,发展了一种可在全水相中"绿色"合成较高浓度的聚甲基丙烯酸(PMAA)纳米水凝胶的新方法.以PMAA纳米水凝胶为前驱体,采用原位氧化沉淀法制备了磁性PMAA纳米微球.利用动态光散射法、FTIR分析、TEM观察、振动样品磁强计测试(VSM)、热重分析(TG)等对纳米水凝胶和磁性微球进行了表征,并探讨了PMAA纳米水凝胶的形成机理.结果表明,吐温20与MAA和PMAA间的氢键作用,促成了交联PMAA/吐温20复合物层在PMMA种子乳胶表面的选择性生长,导致生成了具有核壳结构的PMAA纳米水凝胶.PMAA纳米水凝胶表现出良好的p H响应性,当介质的p H值由1增加至6时,其流体力学体积扩张了近50倍.磁性PMAA纳米微球具有超顺磁性,其饱和磁化强度高达50 A·m^2/kg.

关键词：聚甲基丙烯酸纳米水凝胶 pH响应性磁响应性合成

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聚甲基丙烯酸基纳米水凝胶的“绿色”合成

高分子学报 2015年第6期25卷 713-719页

作者：张幼维何艳顾文娟徐晶张武警赵炯心纤维材料改性国家重点实验室东华大学材料学院

利用原位生成的聚甲基丙烯酸甲酯种子乳胶模板以及表面活性剂与功能单体间的正负电荷作用,发展了一种可在全水相中"绿色"合成聚甲基丙烯酸(PMAA)基纳米水凝胶的新方法.利用动态光散射法、ζ-电位测定、FTIR和TEM对纳米水凝胶的尺寸及其... 详细信息

利用原位生成的聚甲基丙烯酸甲酯种子乳胶模板以及表面活性剂与功能单体间的正负电荷作用,发展了一种可在全水相中"绿色"合成聚甲基丙烯酸(PMAA)基纳米水凝胶的新方法.利用动态光散射法、ζ-电位测定、FTIR和TEM对纳米水凝胶的尺寸及其分布、表面电荷、组成、形态、结构和p H响应行为进行了表征.结果表明,PMAA基纳米水凝胶具有聚甲基丙烯酸甲酯内核和交联聚甲基丙烯酸外壳的核壳结构.当甲基丙烯酸(MAA)的用量由2 m L增至3 m L时,PMAA基纳米水凝胶的尺寸变大.当MAA的用量增加至5 m L时,反应体系中除了生成PMAA基纳米水凝胶外,还生成了PMAA次级粒子.PMAA基纳米水凝胶表现出良好的p H响应性:当介质的p H值由2增加至7时,其流体力学体积扩张了近80倍.

关键词：聚甲基丙烯酸 pH响应性纳米水凝胶正负电荷作用合成

还原敏感胱氨酸二甲酯交联PMAA纳米水凝胶的制备

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精细化工 2016年第9期33卷 977-983页

作者：蒋刚锋翁金鹏孔令平徐晖刘明哲沈阳药科大学基于靶点的药物设计与研究教育部重点实验室辽宁沈阳110016 沈阳药科大学药学院辽宁沈阳110016

以N,N'-双(甲基丙烯酰)胱氨酸二甲酯为交联剂,采用蒸馏沉淀聚合法制备了还原敏感聚甲基丙烯酸(PMAA)纳米水凝胶。使用红外光谱仪、激光粒度仪、扫描电子显微镜对纳米水凝胶的组成、粒径及形貌进行了表征,考察了交联剂用量、单体用量、... 详细信息

以N,N'-双(甲基丙烯酰)胱氨酸二甲酯为交联剂,采用蒸馏沉淀聚合法制备了还原敏感聚甲基丙烯酸(PMAA)纳米水凝胶。使用红外光谱仪、激光粒度仪、扫描电子显微镜对纳米水凝胶的组成、粒径及形貌进行了表征,考察了交联剂用量、单体用量、引发剂用量以及反应时间对纳米水凝胶粒径及产率的影响,结果表明,通过改变制备条件可以得到不同尺寸的纳米水凝胶,其中交联剂用量及反应时间对微球粒径的影响最显著,并通过正交实验优化出最佳工艺条件,即n(引发剂)∶n(单体)∶n(交联剂)=1.1∶96∶2.9,反应时间为15 min。此外,该纳米水凝胶在10 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)还原性条件下能够在20 min内快速响应降解,展示出良好的还原敏感性能。

关键词： N,N'-双(甲基丙烯酰)胱氨酸二甲酯聚甲基丙烯酸还原响应纳米水凝胶功能材料

pH响应的DNA纳米水凝胶用于mRNA递送与表达的研究

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pH响应的DNA纳米水凝胶用于mRNA递送与表达的研究

作者：富欣上海大学

学位级别：硕士

mRNA递送克服了转基因中感染和突变风险等问题,因此,通过递送mRNA来控制蛋白质的表达已成为当前的热点并引起了广泛的关注,成为制备疫苗和开发药物的重要新兴途径。目前尽管有一些将mRNA递送到细胞的载体,但它们在表达效率和生物相容性... 详细信息

mRNA递送克服了转基因中感染和突变风险等问题,因此,通过递送mRNA来控制蛋白质的表达已成为当前的热点并引起了广泛的关注,成为制备疫苗和开发药物的重要新兴途径。目前尽管有一些将mRNA递送到细胞的载体,但它们在表达效率和生物相容性方面是不令人满意的。因此,在本论文工作中我们研发了用于mRNA递送的DNA纳米水凝胶。纳米水凝胶除目标mRNA外全部由DNA组成,因此与那些化学合成的载体相比具有优越的生物相容性;同时,纳米水凝胶由精心设计的“X”形DNA十字架和DNA接头通过交联形成纳米球,因而促进其通过内吞作用递送到细胞中。另外,通过将pH响应性i-motif结构掺入到纳米水凝胶中,实现了mRNA在细胞内的智能释放。因此,结合有效的递送和释放,纳米水凝胶中的mRNA可以高效地翻译成相应的蛋白质,mRNA表达效率与市场化脂质体相当,但具有更好的生物相容性。该纳米水凝胶系统已分别成功递送编码高斯荧光素酶（Gluc,一种分泌蛋白）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP,一种细胞内蛋白）的mRNA。由于其出色的生物相容性和表达效率,该纳米水凝胶系统有望成为在体外和体内递送功能性mRNA的潜在选择。论文工作主要包括以下三个方面:1.pH响应性的纳米水凝胶的构建DNA纳米水凝胶系统能否被成功构建将影响其功能,因此我们首先对其组装进行了研究。该系统以DNA为基础负载mRNA,使mRNA能递送到细胞内并表达出所编码的蛋白质。该系统设计并采用具有i-motif的DNA十字架和DNA接头序列,使目标mRNA与DNA十字架交联,形成具有紧密纳米球结构的纳米水凝胶。通过电泳对DNA十字架和DNA接头的组装进行了验证,结果表明DNA十字架和DNA接头可以顺利组装。我们进一步研究了DNA十字架和DNA接头的pH响应能力,结果表明在酸性条件下,DNA十字架和DNA接头解体,而在中性或碱性条件下,DNA十字架和DNA接头可以顺利组装。2.pH响应性的纳米水凝胶负载mRNA的胞内递送将前述的纳米水凝胶递送至细胞内验证其mRNA的递送能力以及生物安全性。首先,我们根据细胞内的激光共聚焦显微镜成像系统研究了mRNA在细胞内的分布情况。接着通过流式细胞仪分析细胞对纳米水凝胶的摄取能力,以此来进一步证实纳米水凝胶运载mRNA的能力。然后,我们研究了纳米水凝胶进入细胞的途径,结果表明,纳米水凝胶主要是通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞,而少量的纳米水凝胶是通过脂筏-小泡内吞作用进入细胞。我们进一步对mRNA溶酶体逃逸机制进行了研究,结果表明,在存在抑制剂的情况下,m TORC1信号通路被抑制,mRNA的释放也被抑制。该结果与相关报道一致:位于内吞室中的转运蛋白允许mRNA通过溶酶体流出,并参与m TORC1信号通路的激活。此外,我们研究了纳米水凝胶对细胞的毒性作用,通过流式细胞凋亡实验检测对比了脂质体和纳米水凝胶对He La细胞凋亡的影响。结果表明,随着递送的mRNA量的增加,使用脂质体递送mRNA的细胞凋亡率也相应增加,而使用纳米水凝胶组的细胞凋亡率几乎没有变化。CCK-8的结果中也可以得出上述相同的结论。总体而言,这些结果突出了使用纳米水凝胶递送mRNA的安全性优势,并表明纳米水凝胶有望用于需要递送大量mRNA的领域,为后续所运载的mRNA在细胞内的表达奠定基础。3.pH响应性的纳米水凝胶负载mRNA的胞内表达我们进一步对纳米水凝胶所负载的mRNA在细胞内的表达情况进行了研究。酶活测定、RT-PCR、Western blot等分析结果表明,我们所构建的pH响应性纳米水凝胶可以将负载的mRNA成功递送到细胞内并高水平表达相应的蛋白质,表达水平与商品化脂质体相当。在递送和表达效果上,通过与非pH响应性纳米水凝胶的比较研究,我们所构建的pH响应性纳米水凝胶递送系统具有良好的释放mRNA的能力,从而使其在胞内顺利表达合成蛋白质。另外,本研究还表明,我们所构建的纳米水凝胶递送系统具有良好的普适性,对癌细胞（He La细胞）和正常细胞（L02细胞）皆适用,不同种类的mRNA（高斯荧光素酶mRNA和增强型绿色荧光蛋白mRNA）也均能表达,是一种极具潜力的mRNA递送系统。因此,我们构建的DNA纳米水凝胶系统具有将所运载的mRNA递送至细胞质中,并表达所编码蛋白质的能力,并且该递送系统具有良好的稳定性和普适性。

关键词： mRNA 纳米水凝胶 DNA 高斯荧光素酶绿色荧光蛋白