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纳米佐剂增强PEDV免疫效果的分子机制研究

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纳米佐剂增强PEDV免疫效果的分子机制研究

作者：赵莹黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

猪流行性腹泻（porcineepidemicdiarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）引起的一种急性、高度接触性肠道传染病，仔猪死亡率高达90％。本实验室前期的实验结果证实，基于纳米油佐剂（以下简称纳米佐... 详细信息

猪流行性腹泻（porcineepidemicdiarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）引起的一种急性、高度接触性肠道传染病，仔猪死亡率高达90％。本实验室前期的实验结果证实，基于纳米油佐剂（以下简称纳米佐剂）制备的TGE-PED疫苗产生的抗体水平远远优于商品疫苗。为评估纳米佐剂的免疫效果及其发挥免疫作用的机理，通过与传统油佐剂进行比较，分别以卵清蛋白OVA、PEDV为抗原，制备纳米佐剂乳化OVA（Nano-OVA）、PEDV（Nano-PEDV）和201佐剂乳化OVA（201-OVA）、PEDV（201-PEDV）。本实验对纳米佐剂诱导机体产生的免疫应答进行初步评估，并为其临床应用提供理论依据。　　首先，我们以FITC标记的卵清蛋白（FITC-OVA）为抗原模型。为明确纳米佐剂对抗原驻留时间和引流淋巴结的影响，Nano-OVA或201-OVA分别通过足垫皮下免疫C57BL/6小鼠，小动物活体成像、免疫荧光结果表明，在小鼠腘窝淋巴结内，与201-OVA、对照相比，Nano-OVA在小鼠注射位点驻留时间更长;分布更广;并且能够靶向更多的细胞。为探究纳米佐剂对DC2.4细胞吞噬、交叉递呈抗原及其对DC2.4细胞的活化影响，分别将Nano-OVA或201-OVA与DC2.4细胞共孵育，流式细胞术结果表明，与201-OVA、对照组相比，Nano-OVA组DC2.4细胞FITC-OVA+%和PE-25-D1.16+%水平极显著升高（p＜0.001）。qPCR结果显示，Nano-OVA组DC2.4细胞CD86和IL-6mRNA转录水平极显著高于201-OVA处理组（p＜0.01）;Nano-OVA处理组DC2.4细胞IL-12p40mRNA转录水平显著高于201-OVA处理组（p＜0.05）。　　为进一步探究纳米佐剂乳化PEDV诱导机体产生适应性免疫应答的能力，以PEDVG2型代表流行毒株（LNCT）为免疫原。以小鼠为动物试验模型部分：为探究纳米佐剂对DC2.4细胞成熟的影响，Nano-PEDV或201-PEDV分别与DC2.4细胞共孵育，流式细胞术结果表明，与201-PEDV、对照相比，Nano-PEDV通过上调CD86，经24h孵育后上调CD80诱导DC2.4细胞成熟。为进一步探究纳米佐剂诱导小鼠脾脏不同树突状细胞（DCs）成熟（CD80表达）的情况，Nano-PEDV或201-PEDV分别通过足垫皮下接种C57BL/6小鼠，流式细胞术结果表明，在免疫38h后，与201-PEDV、对照相比，Nano-PEDV无法通过上调CD80诱导小鼠脾脏CD11b+CD11c+DCs和CD11c+DCs成熟;与201-PEDV相比，Nano-PEDV无法通过上调CD80诱导小鼠脾脏CD8α+CD11c+DCs成熟。与此相反，在免疫42天时，与201-PEDV、对照相比，Nano-PEDV组PE-CD80平均荧光强度显著增强（p＜0.001）。为探析纳米佐剂对（小鼠骨髓来源树突状细胞）（BMDCs）与脾细胞活化的影响，Nano-PEDV或201-PEDV分别与小鼠BMDCs与脾细胞共孵育，qPCR实验结果表明，与201-PEDV、对照相比，Nano-PEDV能够提升小鼠BMDCs与免疫42天后的小鼠脾脏IL-12p40转录水平促进细胞免疫，而无法通过提升IL-6转录诱导体液免疫。为明确在免疫42天时，纳米佐剂诱导小鼠脾脏免疫反应类型及其分泌细胞因子的差异，Nano-PEDV或201-PEDV分别通过背部皮下接种C57BL/6小鼠，流式细胞术结果表明，与201-PEDV、对照组相比，Nano-PEDV组脾细胞IFN-γ+/CD8+T细胞平均荧光强度极显著升高（plt;0.01），Nano-PEDV组脾细胞IFN-γ+/CD4+T细胞平均荧光强度极显著升高（plt;0.001），Nano-PEDV组淋巴结细胞IFN-γ+/CD8+T细胞平均荧光强度显著升高（plt;0.05），Nano-PEDV组淋巴结IFN-γ+/CD4+T细胞、淋巴结IL-4+/CD4+T细胞、血液IFN-γ+/CD4+T细胞无显著变化（pgt;0.05）。ELISA结果表明，与201-PEDV、对照相比，接种Nano-PEDV的小鼠其脾细胞IFN-γ、TNF-α分泌水平更高，提示其能够更好的诱导细胞免疫应答，而体液免疫的提升并非是由于IL-21、IL-4的分泌所介导。为探究纳米佐剂诱导小鼠产生的中和抗体水平，中和抗体实验表明，与201佐剂、对照相比，纳米佐剂能够更显著地诱导小鼠产生中和抗体。接下来是以仔猪为动物试验模型部分：为评估纳米佐剂活化仔猪BMDCs的能力，Nano-PEDV或201-PEDV分别与仔猪BMDCs共孵育，流式细胞术结果表明，与201佐剂、对照组相比，纳米佐剂组FITC-MHC-Ⅰ平均

关键词：纳米佐剂树突状细胞细胞免疫体液免疫分子机制

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金属纳米佐剂用于肿瘤免疫治疗的研究进展

药学学报 2023年第8期58卷 2311-2319页

作者：赵倩陈方敏来旖王伟于海军中国科学院上海药物研究所上海201203 中国药科大学药学院江苏南京211198

免疫治疗已成为继手术切除、化疗、放疗和靶向治疗之后的另一种有效的肿瘤治疗手段。然而,由于肿瘤细胞免疫原性低及免疫抑制性肿瘤微环境,抗原呈递细胞识别并处理肿瘤抗原效率低下,进而导致细胞毒性T淋巴细胞激活与肿瘤浸润不足,这在... 详细信息

免疫治疗已成为继手术切除、化疗、放疗和靶向治疗之后的另一种有效的肿瘤治疗手段。然而,由于肿瘤细胞免疫原性低及免疫抑制性肿瘤微环境,抗原呈递细胞识别并处理肿瘤抗原效率低下,进而导致细胞毒性T淋巴细胞激活与肿瘤浸润不足,这在很大程度上影响了肿瘤免疫治疗的效果。近年来,研究表明多种金属离子在激活先天免疫刺激及克服获得性免疫耐受方面具有突出的调节作用。基于此,科学家们开发了一系列基于金属离子或金属纳米颗粒的纳米佐剂递送系统,提高金属离子在肿瘤组织或淋巴器官内的靶向蓄积水平,从而高效诱导肿瘤细胞免疫原性死亡或是直接激活抗原呈递细胞以启动抗肿瘤特异性免疫应答。本文首先简要概述了多种金属离子在抗肿瘤免疫调节中的作用,随后总结了利用金属纳米佐剂递送系统实现高效抗肿瘤免疫治疗的研究进展,最后并对该领域的主要挑战和可能发展方向进行了展望。

关键词：免疫治疗金属离子纳米佐剂肿瘤疫苗肿瘤免疫微环境

纳米佐剂与免疫检查点抑制剂联合治疗肿瘤的效果研究

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纳米佐剂与免疫检查点抑制剂联合治疗肿瘤的效果研究

作者：赵佳琦北京工业大学

学位级别：硕士

探究Cp G纳米佐剂体外激活树突状细胞(dendritic cell,DC)的免疫佐剂作用,及与检查点抑制剂anti-PD-1联合应用在小鼠黑色素肿瘤模型中的抗肿瘤效果。制备包载Cp G的β-葡聚糖纳米颗粒(Cp G-encapsulated nanoparticle,CNP)并体外培养小... 详细信息

探究Cp G纳米佐剂体外激活树突状细胞(dendritic cell,DC)的免疫佐剂作用,及与检查点抑制剂anti-PD-1联合应用在小鼠黑色素肿瘤模型中的抗肿瘤效果。制备包载Cp G的β-葡聚糖纳米颗粒(Cp G-encapsulated nanoparticle,CNP)并体外培养小鼠骨髓来源的树突细胞,分4组进行免疫处理,分别为PBS免疫对照组,β-葡聚糖纳米载体组(nanoparticle,NP),Cp G免疫组和CNP组,利用流式细胞仪分析DC成熟情况,ELISA分析DC培养上清中相关细胞因子表达;将体外培养的黑色素瘤B16F10细胞接种于C57BL/6N小鼠右后肢皮下,建立肿瘤模型,待肿瘤大小约为50 mm时,挑选肿瘤大小相对一致的60只小鼠均分为6组,其中5组为肿瘤治疗实验组,分别为PBS对照组,anti-PD-1组,NP+anti-PD-1组,Cp G+anti-PD-1组,CNP+anti-PD-1组,第六组为CNP+anti-PD-1+anti-CD8组,探究CD8T细胞在联合免疫治疗中的作用。后颈部皮下注射给药,共给药4次,每次间隔三天,期间隔天测量肿瘤体积,最后一次给药后第三天眼眶取血,测定血浆中IFN-γ浓度,小鼠安乐死后分离肿瘤及脾脏,使用流式细胞术方法检测瘤内浸润性T淋巴细胞比例及脾脏内T细胞比例。实验结果表明CNP佐剂能够有效刺激DC成熟,促进IL-6、IL-12、TNF-α分泌,联合anti-PD-1治疗接种肿瘤的小鼠也表现出良好的体内抗肿瘤效果,治疗后小鼠血浆中IFN-γ含量及肿瘤浸润性T淋巴细胞都有明显升高,CD8T细胞删除实验结果表明CD8T细胞在肿瘤免疫治疗中发挥重要作用。本研究构建的纳米佐剂CNP能够有效激活DC,与anti-PD-1联合使用在体内展现协同抗癌作用,显著改善肿瘤微环境,具有良好的体内抗肿瘤效果。

关键词： CpG ODN anti-PD-1 纳米佐剂肿瘤微环境黑色素瘤

靶向脾树突状细胞纳米佐剂的构建及增强非洲猪瘟抗原免疫效果评价

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靶向脾树突状细胞纳米佐剂的构建及增强非洲猪瘟抗原免疫效果评价

作者：霍健河南农业大学

学位级别：硕士

病毒性传染病目前在全球范围内呈大流行趋势,严重威胁公共卫生安全和社会的经济发展。接种疫苗是控制、预防传染病最有效的手段之一。佐剂在疫苗的使用中发挥着十分重要的作用。目前常用的佐剂主要以铝佐剂、油乳佐剂为主。其中铝佐剂... 详细信息

病毒性传染病目前在全球范围内呈大流行趋势,严重威胁公共卫生安全和社会的经济发展。接种疫苗是控制、预防传染病最有效的手段之一。佐剂在疫苗的使用中发挥着十分重要的作用。目前常用的佐剂主要以铝佐剂、油乳佐剂为主。其中铝佐剂可以诱导机体产生体液免疫应答,但也会导致一定的不良反应,如肿胀、发热等。因此,需要开发一种安全、有效的佐剂用于增强抗原的免疫应答效果。本研究使用DSPE-PEG-Man与chol-Cp G共修饰的RBCm包被PLGA纳米颗粒,构建了具有脾脏DC靶向作用的CMR-PLGA纳米佐剂。皮下注射后,基于RBCm的脾靶向作用、甘露糖和MR之间的靶向作用,将抗原靶向递送至脾脏的DC,提高DC对抗原的摄取,从而促进抗原呈递,DC成熟,T细胞活化和B细胞成熟,提高抗原特异性抗体的效价,实现了增强体液和细胞免疫的目的。具体研究内容如下所示:1.构建CMR-PLGA纳米佐剂,并对其进行表征。首先,使用复乳法构建CMR-PLGA纳米佐剂。SDS-PAGE图像表明RBCm包被在纳米佐剂表面。经DLS检测,RBCm包被前粒径为158 nm,Zeta电位为-14.2 m V;RBCm包被后纳米佐剂粒径为173 nm,Zeta电位为-23.3 m V。在PBS与血清中有着良好的稳定性。对抗原的包封率75%,30天的累积释放量为67.4%,起到了缓释作用。并且以冻干粉的形式保存复溶后,粒径无明显变化。2.评估CMR-PLGA纳米佐剂的靶向性。使用荧光标记的纳米佐剂与BMDC共孵育,检测其摄取效果。激光共聚焦图像、流式细胞术与荧光定量结果均表明纳米佐剂显著提高了DC的摄取。小动物活体成像观察到纳米佐剂明显富集于脾脏。表明CMR-PLGA纳米佐剂具有良好的脾脏DC靶向作用。3.体外评估CMR-PLGA纳米佐剂对DC成熟和呈递抗原的影响。CMR-PLGA纳米佐剂可显著促进DC表面MHC、CD80、CD86的表达,和相关细胞因子(TNF-α,IL-12,IFN-γ)的分泌。从而实现有效的刺激DC成熟,促进抗原的呈递。4.纳米佐剂体内免疫效果评价。选用ASFV p54蛋白为抗原,弗氏佐剂为阳性对照。对小鼠进行免疫接种后,CMR-PLGA纳米佐剂可有效刺激脾脏中DC的成熟,T细胞的活化,B细胞的成熟,诱导产生了高滴度的p54特异性抗体,并且表现出良好的生物安全性。本文成功构建一种具有脾脏靶向作用的纳米佐剂(CMR-PLGA),具有良好的稳定性和生物相容性。可以诱导机体产生较高水平的细胞免疫与体液免疫应答,是一种具有潜力的安全、高效的新型佐剂。本研究为动物疫苗佐剂的研究提供了新的试验基础和思路。

关键词：靶向性纳米佐剂疫苗聚乳酸-羟基乙酸非洲猪瘟

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多功能纳米佐剂在肿瘤疫苗中的应用

化学进展 2015年第2期27卷 275-285页

作者：张茜朱艳红徐辉碧杨祥良华中科技大学生命科学与技术学院国家纳米药物工程技术研究中心武汉430074

作为一种新的治疗策略,免疫疗法已发展成为继手术、化疗和放疗之后的第四种肿瘤治疗手段,并展现出良好的应用前景。肿瘤免疫治疗的方法种类繁多,其中将纳米技术应用于治疗性的肿瘤疫苗,极大地提高了疫苗的效应。本文介绍了纳米佐剂在肿... 详细信息

作为一种新的治疗策略,免疫疗法已发展成为继手术、化疗和放疗之后的第四种肿瘤治疗手段,并展现出良好的应用前景。肿瘤免疫治疗的方法种类繁多,其中将纳米技术应用于治疗性的肿瘤疫苗,极大地提高了疫苗的效应。本文介绍了纳米佐剂在肿瘤疫苗中的多种功能,重点介绍了几种纳米粒子的合成方法和疫苗治疗效果,总结了纳米技术用于肿瘤免疫治疗的一些新思路,并对应用纳米技术解决肿瘤疫苗面临的挑战进行了初步的分析和展望。

关键词：免疫治疗肿瘤疫苗纳米佐剂交叉呈递

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纳米佐剂在抗病毒疫苗中的应用

生物技术通讯 2019年第1期30卷 128-133页

作者：梁皓胡秦盛望北京工业大学生命科学与生物工程学院北京100124

尽管投入了大量的人力物力,但仍有多种临床相关的病毒预防性疫苗未被开发出来,其中包括人免疫缺陷病毒等对人类健康产生严重威胁的病原体。目前,疫苗开发过程中的一些问题可以通过添加佐剂来解决。因为纳米颗粒的化学和结构特性具有提... 详细信息

尽管投入了大量的人力物力,但仍有多种临床相关的病毒预防性疫苗未被开发出来,其中包括人免疫缺陷病毒等对人类健康产生严重威胁的病原体。目前,疫苗开发过程中的一些问题可以通过添加佐剂来解决。因为纳米颗粒的化学和结构特性具有提高免疫原性的功能,因此它们作为疫苗佐剂得到了广泛研究。纳米佐剂已应用到病毒疫苗领域中并获得了巨大的成功。本文旨在综述纳米佐剂的特点与分类及其在病毒疫苗中的应用。

关键词：纳米佐剂病毒疫苗

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纳米佐剂在疫苗研究中的应用

微生物学免疫学进展 2018年第5期46卷 80-85页

作者：侯永利吴晓霞胡四海南华大学病原生物学研究所湖南衡阳421001

纳米佐剂(nanoparticle-based adjuvants)是指粒径<1 000 nm的佐剂。与传统佐剂相比,纳米佐剂因具有靶向性、缓释性、安全性及高效性等优点而受到疫苗研究者的青睐。特别是其在免疫辅佐效果和安全性方面表现出极大的优势,促进了许多新... 详细信息

纳米佐剂(nanoparticle-based adjuvants)是指粒径佐剂。与传统佐剂相比,纳米佐剂因具有靶向性、缓释性、安全性及高效性等优点而受到疫苗研究者的青睐。特别是其在免疫辅佐效果和安全性方面表现出极大的优势,促进了许多新型疫苗在临床上的广泛应用。同时,纳米佐剂可提高基因转染效率,这一特征为核酸疫苗的应用提供了可能。现从纳米佐剂的组成成分、作用机制、免疫辅佐效果以及临床应用等方面对几种极具潜力的纳米佐剂作一概述。

关键词：纳米佐剂作用机制辅佐效果疫苗

纳米佐剂增强弓形虫SRS9基因核酸疫苗的免疫效能研究

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纳米佐剂增强弓形虫SRS9基因核酸疫苗的免疫效能研究

CpG ODN纳米佐剂的免疫效应及应用进展

中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会

作者：林皑叶翀黄科星赵爽刁雪崇陈晓光吴焜广东省新发传染病防治重点实验室南方医科大学公共卫生与热带医学学院病原生物学系

为研制高效弓形虫核酸疫苗,预防弓形虫感染,本研究选取弓形虫缓殖子含量最丰富的表膜蛋白SRS9基因为疫苗候选基因。为提高其免疫原性,选取纳米材料entranster-invivo作为佐剂,探究其提高核酸疫苗免疫原性的效果。通过构建重组质粒pVAX1-... 详细信息

为研制高效弓形虫核酸疫苗,预防弓形虫感染,本研究选取弓形虫缓殖子含量最丰富的表膜蛋白SRS9基因为疫苗候选基因。为提高其免疫原性,选取纳米材料entranster-invivo作为佐剂,探究其提高核酸疫苗免疫原性的效果。通过构建重组质粒pVAX1-SRS9制备核酸疫苗,将BALB/c小鼠随机分为5组进行免疫试验。A组为空白对照组,B组为纳米佐剂对照组,C组为空质粒对照组,D组为重组质粒免疫组,E组为重组质粒和纳米佐剂共同免疫组。通过检测血清中IgG抗体、淋巴细胞增殖试验等评价免疫接种产生的特异性体液及细胞免疫,同时通过弓形虫RH株及PRU株攻击感染试验探究其免疫保护性。结果显示,重组质粒免疫组及重组质粒和纳米佐剂共同免疫组血清中抗SRS9蛋白IgG抗体水平随免疫次数增加而增高,其中重组质粒和纳米佐剂共同免疫组增高最为明显,且显著高于各对照组。淋巴细胞增殖试验显示重组质粒免疫组及重组质粒和纳米佐剂共同免疫组SI指数均增高。弓形虫RH株攻击感染试验结果显示各组死亡时间无显著性差异。PRU株慢性感染试验结果显示,重组质粒和纳米佐剂共同免疫组小鼠脑内包囊数量显著低于其他组别。研究结果说明纳米佐剂entranster-in vivo能够增强弓形虫SRS9基因核酸疫苗免疫效能,减少慢性感染弓形虫脑内包囊数量。纳米佐剂的运用为弓形虫核酸疫苗的研制开阔了思路。

关键词：弓形虫核酸疫苗包囊缓殖子纳米佐剂 SRS9基因

来源： cnki会议评论

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湖北农业科学 2020年第13期59卷 10-13,18页

作者：王征帆万曾培高小鹏应碧云向蕊李祎云庞旋飞李中圣白挨泉佛山科学技术学院广东佛山528231 广东海大畜牧兽医研究院有限公司广州511400

CpG ODN是人工合成的具有非特异性免疫刺激的DNA序列,模拟细菌DNA在体内的应答过程,诱发细胞和体液免疫。CpG ODN作为新型免疫增强剂在兽医临床上的应用展现出了巨大的潜力,并在免疫学、药物学和药效学等领域备受关注。然而CpG ODN并不... 详细信息

CpG ODN是人工合成的具有非特异性免疫刺激的DNA序列,模拟细菌DNA在体内的应答过程,诱发细胞和体液免疫。CpG ODN作为新型免疫增强剂在兽医临床上的应用展现出了巨大的潜力,并在免疫学、药物学和药效学等领域备受关注。然而CpG ODN并不稳定且易被核酸酶酶解,其自身带负电荷,不易结合到细胞表面。因此,CpG ODN如何高效传递并能有效摄取成了新的挑战。纳米传递系统的研究使CpG ODN单独或协同疫苗免疫取得显著疗效,为改善CpG ODN在疫苗研究中的应用拓宽了思路。从CpG ODN纳米佐剂的作用机制、免疫活性、安全性及临床应用等方面进行综述,并对该领域未来的研究方向进行展望,为后续工作提供有益参考。

关键词： CpG ODN 纳米佐剂作用机制免疫活性安全性