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中国血吸虫病防治杂志 2011年第1期23卷 99-102页

作者：刘琴李石柱张仪周晓农中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室上海200025

无脊椎动物的天然免疫是当今研究的热点之一。研究表明,在无脊椎动物免疫防御作用中,纤维蛋白原相关蛋白(Fibrinogen-related proteins,FREPs)起重要作用,被认为是参与免疫防御最重要的分子之一。本文从FREPs的分子结构、分子多态性及功... 详细信息

无脊椎动物的天然免疫是当今研究的热点之一。研究表明,在无脊椎动物免疫防御作用中,纤维蛋白原相关蛋白(Fibrinogen-related proteins,FREPs)起重要作用,被认为是参与免疫防御最重要的分子之一。本文从FREPs的分子结构、分子多态性及功能3方面介绍了FREPs研究的最新进展,为理解无脊椎动物的天然免疫及宿主和寄生虫的生物共进化机制提供了理论依据。

关键词：纤维蛋白原相关蛋白无脊椎动物多态性功能

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三疣梭子蟹模式识别受体C型凝集素和纤维蛋白原相关蛋白结构及免疫功能研究

三疣梭子蟹模式识别受体C型凝集素和纤维蛋白原相关蛋白结构及免...

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作者：苏越中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)

学位级别：硕士

无脊椎动物缺乏适应性免疫,它识别“非己”主要通过模式识别受体(PRRs)识别入侵微生物的病原相关分子模式(PAMPs)以触发随后的先天免疫应答。本论文利用RACE、实时定量PCR、原核重组表达和RNA干扰等分子生物学技术,对三疣梭子蟹Portunus... 详细信息

无脊椎动物缺乏适应性免疫,它识别“非己”主要通过模式识别受体(PRRs)识别入侵微生物的病原相关分子模式(PAMPs)以触发随后的先天免疫应答。本论文利用RACE、实时定量PCR、原核重组表达和RNA干扰等分子生物学技术,对三疣梭子蟹Portunus trituberculatus的C型凝集素(Pt CLec1和Pt CLec2)和纤维蛋白原相关蛋白(Pt FCN1、Pt FREP1和Pt FREP2)等PRRs进行结构分析和免疫功能的研究。C型凝集素(C-type lectins)是依赖Ca的糖识别蛋白的超家族,在先天免疫系统中起模式识别受体的作用。本研究克隆获得2条C型凝集素基因,分别命名为Pt CLec1和Pt CLec2。Pt CLec1的c DNA全长为873 bp编码176个氨基酸,Pt CLec2的c DNA全长为1175 bp编码267个氨基酸。Pt CLec1和Pt CLec2分别含有特异YPD基序和典型QPD基序的糖识别结构域(CRD)。Pt CLec1主要在肝胰腺中高表达,Pt CLec2主要在肠中高表达,且二者在溶藻弧菌、藤黄微球菌和毕赤酵母菌刺激后表达明显上调。重组蛋白r Pt CLec1和r Pt CLec2可以结合所有检测的PAMPs(脂多糖、肽聚糖和葡聚糖)和微生物(革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌)。在Ca存在下,r Pt CLec1可以很强的凝集细菌和真菌且凝集活性受到D-半乳糖和脂多糖的抑制,r Pt CLec2对细菌具有很强的凝集活性但对真菌无作用,且凝集活性受到D-半乳糖、D-甘露糖和脂多糖的抑制。同时,r Pt CLec1和r Pt CLec2对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有明显的抑菌活性,能够在体外促进对溶藻弧菌的清除活性和在体内促进血细胞的吞噬作用。Pt CLec1和Pt CLec2基因敲降后均可显著抑制吞噬作用相关基因的表达。Pt CLec1基因敲降后能够增强酚氧化酶原激活(pro Po)系统相关基因、甘露糖结合凝集素(Pt MBL)和抗菌肽(AMPs)、以及Toll通路和IMD通路关键基因(Pt My D88和Pt Relish)的表达。与之相反,Pt CLec2基因敲降后pro Po系统相关基因、补体系统相关基因(Pt TEP和Ptα2M1)、AMPs和IMD通路关键基因Pt Relish表达显著下调。此外,Pt CLec2基因敲降后JNK通路关键基因(Pt JNK)和Toll通路关键基因(Pt TLR和Pt Pelle)的表达明显上调。纤维蛋白原相关蛋白(Fibrinogen-related proteins,FREPs),也被称为血纤蛋白原结构域免疫凝集素(FBNs),是一类普遍羧基端含纤维蛋白原类似结构域(fibdnogen-1ike FBG domain)的蛋白。本研究克隆获得3条FREPs基因。Pt FCN1的c DNA全长为2019 bp,其氨基酸序列含有一个FBG结构域。Pt FREP1和Pt FREP2的c DNA全长分别为2428 bp和1475 bp,其氨基酸序列均含有一个FBG结构域和卷曲螺旋结构域(coiled-coil domain)。Pt FCN1主要在胃中的表达量最高,Pt FREP1主要在肠中高表达,而Pt FREP2主要在肝胰腺和胃中高表达。经副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌和白斑综合症病毒(WSSV)刺激后,血细胞中的FREPs被不同程度激活。利用RNA干扰技术敲降Pt FCN1和Pt FREP1基因后,血细胞中溶藻弧菌清除速率明显下降。这些结果表明,FREPs不仅能够作为免疫识别中的模式识别受体,而且能够作为调理素清除病原。

关键词：三疣梭子蟹模式识别受体 C型凝集素纤维蛋白原相关蛋白先天免疫

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海葵纤维蛋白原相关蛋白的生物信息学分析

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郑州师范教育 2013年第2期2卷 49-53页

作者：余英才齐麟江西中医学院基础医学院江西南昌330004 铁道警官高等专科学校治安系河南郑州450053

纤维蛋白原相关蛋白(FREPs)是一类包含纤维蛋白原样结构域(FBG)的糖蛋白,广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物中。本文利用生物信息学方法对海葵基因组中存在的FREPs进行搜索,得到了33条较为可靠的同源序列,并进行了多序列比对和构建系统进... 详细信息

纤维蛋白原相关蛋白(FREPs)是一类包含纤维蛋白原样结构域(FBG)的糖蛋白,广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物中。本文利用生物信息学方法对海葵基因组中存在的FREPs进行搜索,得到了33条较为可靠的同源序列,并进行了多序列比对和构建系统进化树分析。

关键词：海葵纤维蛋白原相关蛋白先天性免疫进化

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中华绒螯蟹Ficolin蛋白抗菌免疫的机制研究

中华绒螯蟹Ficolin蛋白抗菌免疫的机制研究

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作者：赵钶华东师范大学

学位级别：硕士

Ficolin是纤维蛋白原相关蛋白家族(FREPs)成员,在脊椎动物和无脊椎动物中作为一种新型凝集素发挥模式识别受体(PRR)的作用。在脊椎动物中,Ficolins是由三个多肽链构成的寡聚蛋白,通过其胶原蛋白样结构域组装成同源三聚体而构成亚基。其... 详细信息

Ficolin是纤维蛋白原相关蛋白家族(FREPs)成员,在脊椎动物和无脊椎动物中作为一种新型凝集素发挥模式识别受体(PRR)的作用。在脊椎动物中,Ficolins是由三个多肽链构成的寡聚蛋白,通过其胶原蛋白样结构域组装成同源三聚体而构成亚基。其中一些Ficolin是血清凝集素,可以与甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶(MASPs)和小甘露聚糖凝集素(MBL)相关蛋白(s MAP)形成复合物,该复合物通过凝集素途径激活补体。在无脊椎动物中,Ficolin具有一个C端保守的纤维蛋白原相关结构域(FRe D),但其N端结构大不相同甚至未知,已知部分Ficolin具有一段卷曲螺旋结构(coiled coil),可能够促使多肽链形成类似哺乳动物Ficolin三聚体寡聚蛋白的作用。无脊椎动物Ficolin在功能上从两种途径发挥作用,一是发挥类似模式识别受体的凝集素作用,它能够识别入侵病原体PAMPs以促进对入侵病原体的清除,从而保护宿主免受感染;二是原始的调理吞噬作用,其作为一种调理素促进血细胞对病原微生物的吞噬作用以达到清除细菌的目的。本论文以中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)为研究对象,探究了Ficolin在调控中华绒螯蟹先天免疫的作用机制。基于中华绒螯蟹全基因组数据库和甲壳动物Ficolin基因序列,搜索和比对出了一种Ficolin同源物,并将其命名为EsFicolin。通过生物信息学分析,发现其具有一个信号肽,一个高度保守的C端纤维蛋白原相关结构域(FRe D)和用于三聚体形成的卷曲螺旋结构。多序列比对的结果证实C端FRe D结构域与其他甲壳动物FRe D结构域相似度极高,表明其在进化上高度保守,是重要的功能域结构。系统发育树的结果表明,EsFicolin与哺乳动物Ficolin聚为一支,而不与甲壳动物聚为一支,暗示EsFicolin在功能上与哺乳动物Ficolin的相似之处。RT-q PCR分析组织分布的结果表明,EsFicolin在肌肉、肝胰腺、肠道、胃和血细胞中均有表达,表明EsFicolin参与较为广泛的生理功能。受金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)刺激后,与对照组相比,EsFicolin在血细胞中显著上调,表明其与抗菌免疫反应的潜在关联。利用大肠杆菌原核表达系统表达和纯化了重组蛋白r EsFicolin,随后的化学交联实验证实重组的r EsFicolin蛋白在双(3-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)辛二酸酯钠盐(BS)存在的情况下,可以形成三聚体寡聚结构,Westren blot结果显示三聚体蛋白对应的条带与单体蛋白对应的条带相比,明显更粗颜色更深,表明三聚体寡聚蛋白数量大于单体蛋白数量,大部分蛋白质均以三聚体的结构存在。为了探究r EsFicolin能否发挥凝集素的作用,我们的凝集试验表明,r EsFicolin对金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌均有很强的凝集活性,且对于革兰氏阴性菌的凝集活性更强。结合实验显示,r EsFicolin对五种革兰氏阴性菌和三种革兰氏阳性菌均具有结合能力,且对革兰氏阴性菌的结合能力更强。后续的多糖结合实验显示r EsFicolin以剂量依赖性的方式与细胞表明病原相关分子模式(PAMPs)结合,揭示了其识别并结合细菌的具体机制。深入研究发现,重组r EsFicolin蛋白可有效去除细菌,并表现出直接抗菌活性。r EsFicolin还可以促进血细胞的吞噬作用以增强细菌清除率。综上所述,EsFicolin作为中华绒螯蟹先天免疫系统中的一种模式识别受体,能够识别细胞表明病原相关分子模式(PAMPs)并凝集和结合细菌。其对抗入侵微生物的途径主要有两种:一方面,EsFicolin具有直接抑制细菌生长的活性,另一方面,发挥调理素的作用,促进中华绒螯蟹血细胞对细菌的吞噬作用,以达到清除细菌,保护宿主免受病原体感染的目的。这些发现表明EsFicolin在中华绒螯蟹的抗菌免疫反应中起着重要作用,本论文丰富了我们对于无脊椎动物Ficolin的功能研究,增强了我们对于无脊椎动物先天免疫系统的认知。

关键词： Ficolin 纤维蛋白原相关蛋白中华绒螯蟹模式识别受体抗菌免疫

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缢蛏ScFREP-1和ScFREP-2的表达特征及免疫功能研究

缢蛏ScFREP-1和ScFREP-2的表达特征及免疫功能研究

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作者：吴应晗上海海洋大学

学位级别：硕士

缢蛏(Sinonovacula constricta)与其它无脊椎动物一样,仅依靠先天免疫机制抵御环境中的微生物病原体。在现今普遍的高密度养殖模式下,贝类在养殖过程中发生大规模病害相对虾蟹和鱼类少。生存于微生物广泛且大量分布的环境中,贝类是如何... 详细信息

缢蛏(Sinonovacula constricta)与其它无脊椎动物一样,仅依靠先天免疫机制抵御环境中的微生物病原体。在现今普遍的高密度养殖模式下,贝类在养殖过程中发生大规模病害相对虾蟹和鱼类少。生存于微生物广泛且大量分布的环境中,贝类是如何做到有效防御病原体入侵,引发研究人员对贝类先天免疫的研究兴趣。纤维蛋白原相关蛋白(fibrinogen-related proteins,FREPs)是指一类羧基端具有相对保守的纤维蛋白原相关结构域(fibrinogen-related domain,FRe D)的蛋白质。近年来有许多研究发现无脊椎动物的纤维蛋白原相关蛋白作为模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)参与先天免疫。本研究鉴定了缢蛏的两个纤维蛋白原相关蛋白基因,该基因参与识别多糖,能够识别和凝集入侵微生物,可能在贝类免疫中起重要作用。1.两个纤维蛋白原相关蛋白基因(Sc FREPs)的序列分析基于缢蛏转录组数据库,筛选获得了两个纤维蛋白原相关蛋白基因的片段,利用RACE技术获得了这两个纤维蛋白原相关蛋白基因的c DNA全长序列,并命名为Sc FREP-1和Sc FREP-2。Sc FREP-1基因全长2065 bp,其中开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)长度为825 bp,编码274个氨基酸,预测分子量为30.28 k Da;Sc FREP-2基因全长1675 bp,开放阅读框长度为882 bp,编码293个氨基酸,预测分子量为33.08 k Da。Blast显示两个基因都只有一个功能结构域—位于C端的纤维蛋白原相关结构域(FRe D)。信号肽预测分析发现Sc FREP-1无信号肽,而Sc FREP-2具有经典分泌信号肽。2.Sc FREPs的早期发育期及成体健康组织表达模式以及细菌感染后表达分析通过qRT-PCR检测了缢蛏的两个纤维蛋白原相关蛋白基因Sc FREP-1和Sc FREP-2在缢蛏健康成体的7个组织,早期发育的7个时期中的表达情况,以及感染细菌后两个基因在血淋巴及肝胰腺中不同时间点的表达变化情况。结果表明,Sc FREP-1在鳃中有显著高表达;Sc FREP-2在外套膜中有极显著高表达,在血淋巴中表达量次之。同受精卵比较,Sc FREP-1从壳顶幼虫时期表达量开始上升,而Sc FREP-2从D型幼虫时期就出现高表达。在金黄色葡萄球菌和鳗弧菌感染后的数小时内,Sc FREP-1和Sc FREP-2表达量变化程度不同,反应出两个基因可能具有不同的免疫反应机制。3.Sc FREPs基因的重组蛋白表达及功能验证由原核表达得到了两个基因的重组蛋白rScFREP-1和rScFREP-2,并研究了两个重组蛋白结合多糖及细菌的能力和凝集细菌的能力。对不同糖类结合能力研究表明两者对N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine,NAG)都有较强的结合能力,并呈现随浓度升高结合活性增强的趋势;rScFREP-1和rScFREP-2对所选细菌均具有结合活性并且能够凝集细菌。该结果表明Sc FREPs可以通过其保守的FRe D识别特定的多糖分子来发挥免疫作用。

关键词：纤维蛋白原相关蛋白缢蛏先天免疫模式识别受体

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