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纤维小体在燃料乙醇中的应用

中国生物工程杂志 2011年第1期31卷 103-108页

作者：黄俊陈东黄日波广西大学生命科学与技术学院南宁530004 广西科学院生物质能源酶解技术国家重点实验室国家非粮生物质能源工程技术研究中心南宁530004

纤维小体在木质纤维素的降解中起着重要作用。它不仅含有降解纤维素所需的各种纤维素酶系,而且组装成具有高效催化活性的多酶复合体形式。介绍了纤维小体基本结构与功能,重点概述了其在生物燃料乙醇中的应用并对纤维小体的研究提出了展望。

关键词：纤维小体生物质应用

复合功能嵌合纤维小体空间结构优化及性能研究

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太阳能学报 2022年第6期43卷 246-250页

作者：杜济良祁琪刘涵王旭昕万平田沈植物基因资源与低碳生物技术北京市重点实验室北京100048 首都师范大学生命科学学院北京100048

该研究成功构建4种杂合纤维小体支架蛋白,并将纤维素酶与其在胞外组装成空间结构不同的嵌合纤维小体,分析了嵌合纤维小体的酶的热稳定性和酶解动力学特征。并基于酿酒酵母EBY100细胞表面展示系统锚定优化前后的支架蛋白以组装嵌合纤维... 详细信息

该研究成功构建4种杂合纤维小体支架蛋白,并将纤维素酶与其在胞外组装成空间结构不同的嵌合纤维小体,分析了嵌合纤维小体的酶的热稳定性和酶解动力学特征。并基于酿酒酵母EBY100细胞表面展示系统锚定优化前后的支架蛋白以组装嵌合纤维小体进行纤维素同步糖化发酵产乙醇性能分析。结果表明嵌合纤维小体的酶活性在50℃下维持相对稳定状态达到120 h。其中ScafI-Ⅳ型支架蛋白嵌合纤维小体的V_(max)=0.147 mg/(mL·min),K_(m)=6.085 mg/mL及水解纤维素的还原糖产量均高于其他3种结构嵌合纤维小体。CBP酿酒酵母菌群以磷酸膨胀纤维素为底物进行同步糖化发酵产乙醇,ScafI-Ⅳ型结构嵌合纤维小体在96 h时乙醇产量达到1.12 g/L,产量为0.263 g/g,相当于乙醇产率理论值的51.50%。该结果证明通过优化支架蛋白结构可改善嵌合纤维小体的酶解性能,并对于人工设计纤维小体的研究具有一定的理论意义。

关键词：酿酒酵母纤维素乙醇空间结构表面展示纤维小体

解纤维梭菌纤维小体黏附域与锚定域相互作用的差异性

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中国生物化学与分子生物学报 2022年第12期38卷 1651-1660页

作者：刘娜闫治华申哲伟许成钢浙江农林大学动物科技学院动物医学院兽医系杭州311300 化学生物学与分子工程教育部重点实验室山西大学生物技术研究所太原030006 山西大学生命科学学院太原030006

黏附域(cohesin)与锚定域(dockerin)的相互作用是纤维素酶复合体-纤维小体(cellulosome)组装的基础,该作用是自然界已知最强的相互作用力之一。为解析纤维小体的装配机制,本研究以解纤维梭菌(Ruminiclostridium cellulolyticum)纤维小... 详细信息

黏附域(cohesin)与锚定域(dockerin)的相互作用是纤维素酶复合体-纤维小体(cellulosome)组装的基础,该作用是自然界已知最强的相互作用力之一。为解析纤维小体的装配机制,本研究以解纤维梭菌(Ruminiclostridium cellulolyticum)纤维小体为研究对象,通过Pull-down和等温滴定量热(ITC)的方法,分析并比较不同簇的3个黏附域与7个锚定域之间的相互作用。结果表明,不同簇黏附域与锚定域的相互作用具有显著差异。其中,Coh1与Doc-0729的相互作用最强,Ka为108 M-1,Coh7与Doc-0729、0931作用力强,Ka为107 M-1,而Coh8与Doc-0931、1656、0752作用强,Ka也达到107 M-1。总之,Doc-0729、0931、1656与3个Coh的结合力均较高。本研究揭示了纤维小体黏附域与锚定域的组装具有偏爱性,这为人工纤维小体的设计和装配奠定了理论基础。

关键词：纤维小体黏附域锚定域相互作用解纤维梭菌

基于纤维小体展示技术的酿酒酵母纤维素乙醇研究进展

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中国科学：化学 2014年第1期44卷 79-84页

作者：范立海谭天伟北京市生物加工过程重点实验室北京化工大学生命科学与技术学院北京100029

利用联合生物加工工艺生产第二代燃料乙醇(纤维素乙醇)是国内外的研究热点.前期的研究结果表明,酿酒酵母分泌或展示非复合型纤维素酶体系的应用效果并不理想,而复合型纤维素酶体系(即纤维小体)因对纤维素的降解能力比非复合型纤维素酶... 详细信息

利用联合生物加工工艺生产第二代燃料乙醇(纤维素乙醇)是国内外的研究热点.前期的研究结果表明,酿酒酵母分泌或展示非复合型纤维素酶体系的应用效果并不理想,而复合型纤维素酶体系(即纤维小体)因对纤维素的降解能力比非复合型纤维素酶体系更强,所以其在酿酒酵母细胞表面的组装研究受到越来越多的关注.目前,单支架和双支架纤维小体在酵母细胞表面的完全自组装以及多细胞协同参与的非完全自组装均已实现.纤维小体展示型酿酒酵母已能直接利用结晶型纤维素发酵生产乙醇,但由于降解模块的结构缺陷,纤维素乙醇的产量仍然偏低.本文对纤维小体的酵母展示技术及其在纤维素乙醇发酵中的应用研究进行了论述,并对该领域的发展方向进行了展望.

关键词：纤维小体纤维素乙醇酿酒酵母联合生物加工工艺

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人工纤维小体骨架蛋白的分子设计与自组装

中国生物化学与分子生物学报 2022年第12期38卷 1694-1702页

作者：闫治华刘娜刘远声许成钢浙江农林大学动物科技学院动物医学院兽医系杭州311300 化学生物学与分子工程教育部重点实验室山西大学生物技术研究所太原030006

纤维小体是厌氧微生物分泌的能够高效降解木质纤维素的一种多酶复合体。其骨架蛋白质的大量重组合成是人工纤维小体构建的关键。为了构建全长的结构复杂的能招募大量酶亚基的骨架蛋白质,本研究对解纤维梭菌Ruminiclostridum cellulolyti... 详细信息

纤维小体是厌氧微生物分泌的能够高效降解木质纤维素的一种多酶复合体。其骨架蛋白质的大量重组合成是人工纤维小体构建的关键。为了构建全长的结构复杂的能招募大量酶亚基的骨架蛋白质,本研究对解纤维梭菌Ruminiclostridum cellulolyticum骨架蛋白CipC进行分子模块化设计,并分别与肽-蛋白质共价偶联系统SpyTag/SpyCatcher和SnoopTag/SnoopCatcher融合表达。然后分别通过非固定化和固定化组装策略对人工纤维小体骨架蛋白质进行了初步组装。结果显示,SpyTag和SpyCatcher、SnoopTag和SnoopCatcher之间自发形成稳定的共价异肽键,而且SpyTag和SnoopCatcher,SnoopTag和SpyCacther之间无交叉反应。最终成功组装出含有不同数量黏附域的骨架蛋白质,实现骨架蛋白链的延伸。本研究为构建结构更复杂、活性更高的人工纤维小体提供了新的设计思路并奠定了其技术基础。

关键词：解纤维梭菌纤维小体骨架蛋白肽-蛋白质共价偶联技术分子设计与固定化组装

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梭热杆菌纤维小体研究进展

生物技术通报 2011年第5期27卷 31-37页

作者：李爽吴宪明陈红漫阚国仕曲谨郁任大明沈阳农业大学生物科学技术学院沈阳110866

梭热杆菌(Clostridium thermocellum)是一种嗜热厌氧细菌,通过分泌大量纤维素酶高效降解纤维素。根据作用纤维素的不同部位,梭热杆菌分泌的纤维素酶分为内切纤维素酶和外切纤维素酶。纤维小体是由支架蛋白、锚定元件、黏合蛋白、纤维素... 详细信息

梭热杆菌(Clostridium thermocellum)是一种嗜热厌氧细菌,通过分泌大量纤维素酶高效降解纤维素。根据作用纤维素的不同部位,梭热杆菌分泌的纤维素酶分为内切纤维素酶和外切纤维素酶。纤维小体是由支架蛋白、锚定元件、黏合蛋白、纤维素结合域和催化单位组成的复合体,其独特的结构,使得它可以比真菌纤维素酶更紧密地结合到纤维素表面,这个复合结构结合着多种催化单位,而此特殊的结构是梭热杆菌高效降解纤维素的必要条件。近年来,为更深入透彻地了解纤维小体的结构与功能进行了大量的研究工作,现对相关研究进展进行综述,并给出了未来可能的发展方向。

关键词：梭热杆菌细菌纤维素纤维素酶纤维小体

厌氧分解纤维素细菌P4-3的产酶特性及其纤维小体组分的定位

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中国沼气 2012年第1期30卷 3-7,16页

作者：马诗淳黄艳赵银瓶孙颖杰贺静邓宇农业部沼气科学研究所成都610041 农业部农村可再生能源开发与利用重点实验室成都610041

中温厌氧纤维素分解菌P4-3可产生活性较高、热稳定性较强的纤维素酶。通过检测CMC酶活性,研究了培养时间、温度、培养基初始pH值、碳源和氮源对其产酶的影响。通过破壁处理,检测不同部位粗酶液中的CMC酶、滤纸酶及β-葡萄糖苷酶活性,分... 详细信息

中温厌氧纤维素分解菌P4-3可产生活性较高、热稳定性较强的纤维素酶。通过检测CMC酶活性,研究了培养时间、温度、培养基初始pH值、碳源和氮源对其产酶的影响。通过破壁处理,检测不同部位粗酶液中的CMC酶、滤纸酶及β-葡萄糖苷酶活性,分析了其纤维小体中三种酶组分的分布和比例。结果显示,利用滤纸和纤维二糖作为底物达到最大酶活的时间分别为144 h和72 h;产酶最佳温度为40℃,pH值为7.5,纤维二糖为最佳碳源,酵母粉为最佳氮源。培养144 h,CMC酶、滤纸酶及β-葡萄糖苷酶在上清液、未破壁菌体悬浮液与破壁菌体悬浮液中的活性比分别为9∶1∶1,14∶4∶3和6∶3∶4。

关键词：厌氧纤维素水解纤维小体组分

黄色瘤胃球菌纤维小体脚手架蛋白ScaC基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

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中国畜牧兽医 2019年第7期46卷 1917-1925页

作者：曹平华李晓霞赵龙妹武晓红许会英马禹龙河南科技大学动物科技学院

为获得纤维小体(cellulosome)的基本元件,本试验以滩羊瘤胃液微生物混合DNA为模板,根据黄色瘤胃球菌纤维小体的脚手架蛋白ScaC基因序列(GenBank登录号:JN109634.1)设计特异性引物,扩增纤维小体脚手架蛋白基因,并对其进行克隆、测序及核... 详细信息

为获得纤维小体(cellulosome)的基本元件,本试验以滩羊瘤胃液微生物混合DNA为模板,根据黄色瘤胃球菌纤维小体的脚手架蛋白ScaC基因序列(GenBank登录号:JN109634.1)设计特异性引物,扩增纤维小体脚手架蛋白基因,并对其进行克隆、测序及核苷酸和氨基酸序列分析;同时构建脚手架蛋白基因原核表达载体,分析其在大肠杆菌中的表达情况。结果显示,试验利用1对引物同时成功克隆获得2个脚手架蛋白编码基因,其中一个基因全长867bp,编码288个氨基酸,命名为ScaC2基因;另一个基因全长870bp,编码289个氨基酸,命名为ScaC7基因。核苷酸序列分析表明,脚手架蛋白基因ScaC2与ScaC7的核苷酸序列相似性为74.1%,ScaC2基因与黄色瘤胃球菌AGY80P318及ScaC7基因与黄色瘤胃球菌DA640P037ScaC基因核苷酸序列相似性均为99%;氨基酸保守序列分析显示,ScaC2和ScaC7氨基酸序列均具有典型的脚手架蛋白结构域,含有1个Ⅰ型黏附域和1个Ⅰ型锚定域。蛋白表达分析显示,ScaC2和ScaC7基因均能在大肠杆菌中实现可溶性表达,表达产物大小约为33ku。本试验克隆获得的纤维小体的脚手架蛋白基因ScaC2和ScaC7可为后续人工纤维小体的构建提供基本材料。

关键词：纤维小体脚手架蛋白克隆表达

基于纤维小体组装的合成β-丙氨酸工程菌构建技术研究

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基于纤维小体组装的合成β-丙氨酸工程菌构建技术研究

作者：陆捷齐鲁工业大学

学位级别：硕士

β-丙氨酸广泛应用于食品添加剂、药品和保健品等领域。目前微生物发酵法及酶催化法逐步替代化学合成法合成β-丙氨酸,具有环保、温和、高效率等特点。β-丙氨酸多用酶法催化L-天冬氨酸或富马酸合成,底物成本较高,本研究采用基因敲除和... 详细信息

β-丙氨酸广泛应用于食品添加剂、药品和保健品等领域。目前微生物发酵法及酶催化法逐步替代化学合成法合成β-丙氨酸,具有环保、温和、高效率等特点。β-丙氨酸多用酶法催化L-天冬氨酸或富马酸合成,底物成本较高,本研究采用基因敲除和多酶共表达的手段,对合成β-丙氨酸的大肠杆菌代谢途径进行研究,实现了以葡萄糖为原料的β-丙氨酸合成,具体内容如下:(1)对产L-赖氨酸的大肠杆菌工程菌株CGMCC 1.366的微生物合成途径进行基因编辑改造,通过对天冬氨酸激酶基因lys C进行基因敲除,成功构建大肠杆菌基因缺陷菌株CGMCC 1.366Δlys C,阻断生产L-赖氨酸的途径,从而增加β-丙氨酸的产量。发酵结果显示,以葡萄糖为原料,原始菌株CGMCC 1.366发酵后L-赖氨酸产量为1260 mg/L,而基因缺陷菌株CGMCC 1.366Δlys C发酵后L-赖氨酸的产量降低为20 mg/L,表明该菌株的L-赖氨酸合成途径被成功阻断。(2)为实现大肠杆菌中以葡萄糖为原料合成β-丙氨酸,分别克隆来自枯草芽孢杆菌的L-天冬氨酸-α-脱羧酶(Pan D)和来自大肠杆菌的天冬氨酸氨基转移酶(Asp C),连接至载体p ET28a(+),构建了双启动子重组载体p ET28a(+)-asp C-pan D并转化到大肠杆菌工程菌CGMCC 1.366Δlys C中进行异源表达。发酵结果显示,在28℃下利用IPTG诱导20 h后37℃条件下发酵培养40 h,合成的β-丙氨酸含量为0.7103 mg/L。为进一步提高合成β-丙氨酸微生物代谢途径中酶的催化效率和产物的合成效率,利用纤维小体关键元件对接蛋白(Doc A)与粘连蛋白(Coh A)的自组装体系结合Pan D和Asp C,提高酶的催化效率和表达水平,并通过双酶催化法进一步促进β-丙氨酸的产量,构建了大肠杆菌工程菌CGMCC 1.366Δlys C/p ET28a(+)-asp C-coh A-pan D-doc A,在28℃下利用IPTG诱导20 h,纤维小体关键元件结合关键酶成功表达。发酵结果显示,在28℃下利用IPTG诱导20 h后37℃条件下发酵培养40 h,合成的β-丙氨酸含量为7.439 mg/L,组装纤维小体的工程菌合成β-丙氨酸的含量是未组装纤维小体的工程菌合成β-丙氨酸的含量10.47倍。(3)优化改变了纤维小体关键元件对接蛋白和粘连蛋白的组装方式,对生产β-丙氨酸的大肠杆菌合成代谢途径的关键酶天冬氨酸氨基转移酶、L-天冬氨酸-α-脱羧酶、苹果酸脱氢酶(MDH)和延胡索酸酶(Fum A)进行两两组装,构建大肠杆菌工程菌。构建的工程菌株在IPTG诱导后蛋白成功表达,发酵结果显示,工程菌株CGMCC 1.366Δlys C/p ET28a(+)-pan D-coh A-asp C-doc A、CGMCC 1.366Δlys C/p ET22b(+)-asp C-coh A-mdh-doc A和CGMCC 1.366Δlys C/p ET22b(+)-coh A-fum A-mdh-doc A在28℃下利用IPTG诱导20 h后37℃条件下发酵培养40 h,合成的β-丙氨酸的含量分别为25.87 mg/L、0.387 mg/L和0.356 mg/L。利用5 L发酵罐进行微生物发酵实验,采用乳糖替代IPTG作为诱导剂,工程菌株CGMCC 1.366Δlys C/p ET28a(+)-pan D-coh A-asp C-doc A催化20 g/L的葡萄糖合成的β-丙氨酸达到755.465 mg/L。纤维小体可以有效地用于β-丙氨酸工程菌株的构建及其衍生物的生产,该方法也为其他氨基酸的生产提供了良好的方法借鉴。

关键词： β-丙氨酸基因敲除纤维小体双酶催化发酵合成