基于纤维小体组装的合成β-丙氨酸工程菌构建技术研究
作者单位:齐鲁工业大学
学位级别:硕士
导师姓名:王瑞明
授予年度:2023年
学科分类:0710[理学-生物学] 081703[工学-生物化工] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 090102[农学-作物遗传育种] 0822[工学-轻工技术与工程]
摘 要:β-丙氨酸广泛应用于食品添加剂、药品和保健品等领域。目前微生物发酵法及酶催化法逐步替代化学合成法合成β-丙氨酸,具有环保、温和、高效率等特点。β-丙氨酸多用酶法催化L-天冬氨酸或富马酸合成,底物成本较高,本研究采用基因敲除和多酶共表达的手段,对合成β-丙氨酸的大肠杆菌代谢途径进行研究,实现了以葡萄糖为原料的β-丙氨酸合成,具体内容如下:(1)对产L-赖氨酸的大肠杆菌工程菌株CGMCC 1.366的微生物合成途径进行基因编辑改造,通过对天冬氨酸激酶基因lys C进行基因敲除,成功构建大肠杆菌基因缺陷菌株CGMCC 1.366Δlys C,阻断生产L-赖氨酸的途径,从而增加β-丙氨酸的产量。发酵结果显示,以葡萄糖为原料,原始菌株CGMCC 1.366发酵后L-赖氨酸产量为1260 mg/L,而基因缺陷菌株CGMCC 1.366Δlys C发酵后L-赖氨酸的产量降低为20 mg/L,表明该菌株的L-赖氨酸合成途径被成功阻断。(2)为实现大肠杆菌中以葡萄糖为原料合成β-丙氨酸,分别克隆来自枯草芽孢杆菌的L-天冬氨酸-α-脱羧酶(Pan D)和来自大肠杆菌的天冬氨酸氨基转移酶(Asp C),连接至载体p ET28a(+),构建了双启动子重组载体p ET28a(+)-asp C-pan D并转化到大肠杆菌工程菌CGMCC 1.366Δlys C中进行异源表达。发酵结果显示,在28℃下利用IPTG诱导20 h后37℃条件下发酵培养40 h,合成的β-丙氨酸含量为0.7103 mg/L。为进一步提高合成β-丙氨酸微生物代谢途径中酶的催化效率和产物的合成效率,利用纤维小体关键元件对接蛋白(Doc A)与粘连蛋白(Coh A)的自组装体系结合Pan D和Asp C,提高酶的催化效率和表达水平,并通过双酶催化法进一步促进β-丙氨酸的产量,构建了大肠杆菌工程菌CGMCC 1.366Δlys C/p ET28a(+)-asp C-coh A-pan D-doc A,在28℃下利用IPTG诱导20 h,纤维小体关键元件结合关键酶成功表达。发酵结果显示,在28℃下利用IPTG诱导20 h后37℃条件下发酵培养40 h,合成的β-丙氨酸含量为7.439 mg/L,组装纤维小体的工程菌合成β-丙氨酸的含量是未组装纤维小体的工程菌合成β-丙氨酸的含量10.47倍。(3)优化改变了纤维小体关键元件对接蛋白和粘连蛋白的组装方式,对生产β-丙氨酸的大肠杆菌合成代谢途径的关键酶天冬氨酸氨基转移酶、L-天冬氨酸-α-脱羧酶、苹果酸脱氢酶(MDH)和延胡索酸酶(Fum A)进行两两组装,构建大肠杆菌工程菌。构建的工程菌株在IPTG诱导后蛋白成功表达,发酵结果显示,工程菌株CGMCC 1.366Δlys C/p ET28a(+)-pan D-coh A-asp C-doc A、CGMCC 1.366Δlys C/p ET22b(+)-asp C-coh A-mdh-doc A和CGMCC 1.366Δlys C/p ET22b(+)-coh A-fum A-mdh-doc A在28℃下利用IPTG诱导20 h后37℃条件下发酵培养40 h,合成的β-丙氨酸的含量分别为25.87 mg/L、0.387 mg/L和0.356 mg/L。利用5 L发酵罐进行微生物发酵实验,采用乳糖替代IPTG作为诱导剂,工程菌株CGMCC 1.366Δlys C/p ET28a(+)-pan D-coh A-asp C-doc A催化20 g/L的葡萄糖合成的β-丙氨酸达到755.465 mg/L。纤维小体可以有效地用于β-丙氨酸工程菌株的构建及其衍生物的生产,该方法也为其他氨基酸的生产提供了良好的方法借鉴。