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肠出血性大肠杆菌O157P:H7紧密黏附素的基因克隆、表达及功能研究

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南方医科大学学报 2009年第4期29卷 707-710页

作者：彭丽娟周勇杨瑜惠长野赵卫万成松南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系广东广州510515 广州市疾病预防控制中心广东广州510380

目的获得高纯度的eae基因表达蛋白紧密黏附素(Intimin),研究其黏附作用。方法从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7全基因组中扩增出eae基因,T-A克隆后,将eae插入载体pET28a(+),并转化至*** BL21(DE3)中表达;用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出重组蛋... 详细信息

目的获得高纯度的eae基因表达蛋白紧密黏附素(Intimin),研究其黏附作用。方法从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7全基因组中扩增出eae基因,T-A克隆后,将eae插入载体pET28a(+),并转化至*** BL21(DE3)中表达;用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出重组蛋白;SDS-PAGE检测目的蛋白相对分子质量,免疫印记分析其免疫反应性,免疫荧光检测其黏附性。结果获得了大小约2805bp的eae片段;构建了重组载体pET28a(+)-eae,并在*** BL21(DE3)中以包涵体形式表达Intimin,Mr约97000;Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出Intimin;大肠杆菌O157:H7多抗血清在Mr约97000处检测出一条特异性Intimin带;Intimin可黏附在HEp-2细胞表面。结论高纯度的重组蛋白Intimin具有一定的免疫反应性,能与HEp-2细胞黏附,为进一步研究Intimin蛋白与宿主受体蛋白的相互作用奠定基础。

关键词：肠出血性大肠杆菌 0157:H7 eae 紧密黏附素基因克隆重组表达免疫印记免疫荧光

肠出血性大肠杆菌紧密黏附素保护性多肽的表达与免疫原性分析

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军事医学科学院院刊 2008年第4期32卷 316-318页

作者：高翔包士中史晶蔡昆刘昊侯晓军王慧军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的:在基因工程菌中实现肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7紧密黏附素(intimin)保护性片段(Int281)的高效表达,并进行抗原性的初步分析。方法:应用PCR从EHEC O157∶H7基因组中钓取int281基因,插入pMD18-T克隆载体。克隆质粒测序鉴定后,采... 详细信息

目的:在基因工程菌中实现肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7紧密黏附素(intimin)保护性片段(Int281)的高效表达,并进行抗原性的初步分析。方法:应用PCR从EHEC O157∶H7基因组中钓取int281基因,插入pMD18-T克隆载体。克隆质粒测序鉴定后,采用NdeⅠ、NotⅠ限制性核酸内切酶双酶切pMD18-T-int281质粒获得int281基因,连接同样经过双酶切的pET-22b(+)。表达质粒测序鉴定后转化***21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测相对分子质量和Western印迹验证免疫学活性后,重组Int281蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA检测鼠血清抗体效价。结果:PCR扩增得到843 bp的目的片段。构建的原核表达质粒pET-22b(+)-int281经酶切鉴定及测序与预期序列一致。目的蛋白以包涵体形式表达,表达量约25%。变性复性后经镍柱纯化后纯度达95%以上。免疫印迹检测显示,重组Int281片段可以特异性地识别抗O157∶H7多抗。免疫小鼠抗体效价达1∶106。结论:重组Int281具有良好的免疫原性,为制备相应的抗体及研究其对EHEC O157∶H7黏附定植的被动保护效果奠定了基础。

关键词：肠出血性大肠杆菌紧密黏附素免疫原性

肠致病性大肠杆菌紧密黏附素的作用机制及基因分型研究进展

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中国人兽共患病学报 2022年第6期38卷 528-532页

作者：杨蕾李俊霖申玉玺罗钰雯夏静黄勇颜其贵邹立扣韩新锋四川农业大学动物医学院成都611130 动物疫病与人类健康四川省重点实验室成都611130 四川农业大学资源学院成都611130

肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)引起的腹泻性疾病是世界范围内重要的公共卫生问题。在EPEC黏附肠道细胞的过程中,紧密黏附素与易位受体Tir相互作用触发了肌动蛋白的组装,在细菌与宿主细胞连接部位形成了紧... 详细信息

肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)引起的腹泻性疾病是世界范围内重要的公共卫生问题。在EPEC黏附肠道细胞的过程中,紧密黏附素与易位受体Tir相互作用触发了肌动蛋白的组装,在细菌与宿主细胞连接部位形成了紧密附着的基座。紧密黏附素不仅是EPEC产生特征性黏附/消除病变的关键因子,还对宿主具有不同的组织向性。编码紧密黏附素的eae基因是鉴定EPEC菌株的靶点,其序列存在相当大的异质性,是EPEC分型的重要遗传学基础。同时,携带不同eae亚型的LEE致病岛可能在不同血清型、不同类型的致泻性大肠杆菌菌株之间发生水平转移。因此,在预测EPEC腹泻性流行病的严重程度时,可对EPEC菌株的eae基因变异做鉴定和分型,为监测方向提供参考。

关键词：肠致病性大肠杆菌紧密黏附素黏附机制致病性基因分型

分子模拟研究不同随机RNA片段适体与大肠杆菌紧密黏附素的相互作用

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计算机与应用化学 2016年第8期33卷 881-885页

作者：王明华李杜娟忻州师范学院生物系山西忻州034000 杭州电子科技大学生命信息与仪器工程学院浙江杭州310018

为了促进开发大肠杆菌快速检测适体生物传感器,通过对已知RNA-蛋白质相互作用原理和复合物结构的分析,在对相关文献资料和基于分子模拟技术的网络资源充分了解的基础上,模拟预测研究了随机RNA序列与肠致病性大肠杆菌紧密黏附素蛋白的相... 详细信息

为了促进开发大肠杆菌快速检测适体生物传感器,通过对已知RNA-蛋白质相互作用原理和复合物结构的分析,在对相关文献资料和基于分子模拟技术的网络资源充分了解的基础上,模拟预测研究了随机RNA序列与肠致病性大肠杆菌紧密黏附素蛋白的相互作用。结果表明,RNA高级结构主要依赖于其一级结构的序列信息。NPDock模拟不同随机RNA序列与紧密黏附素相互作用时,不同长度RNA序列均可与紧密黏附素发生相互作用,但作用位点和相互位置有一定差异;对于相同长度不同排布的RNA序列,相互作用的差异性主要与序列排布信息有关。对于分子模拟研究RNA-紧密黏附素相互作用方法的可行性,通过RNA-蛋白质相互作用位点在线预测方法(PRIdictor)进行验证,结果表明,预测出的蛋白质、RNA相互作用位点均位于相互作用预测结构的接触面上,说明对于RNA-蛋白质相互作用的模拟预测研究方法具有一定的可行性,将有助于通过设计合成RNA改进适体筛选、研发的相关生物技术推广,以及应用创新。

关键词：紧密黏附素 RNA-蛋白质相互作用分子模拟 NPDock PRIdictor

大肠杆菌O157:H7紧密黏附素空间结构建模研究

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计算机与应用化学 2015年第8期32卷 933-937页

作者：王明华李杜娟忻州师范学院生物系山西忻州034000 杭州电子科技大学生命信息与仪器工程学院浙江杭州310018

肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密黏附素是一种致病性相关的跨膜蛋白,C端区域具有免疫原性。本研究以肠致病性大肠杆菌的紧密黏附素C端空间结构为模板,利用Build Homology Models同源建模构建目标序列——肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密黏附... 详细信息

肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密黏附素是一种致病性相关的跨膜蛋白,C端区域具有免疫原性。本研究以肠致病性大肠杆菌的紧密黏附素C端空间结构为模板,利用Build Homology Models同源建模构建目标序列——肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密黏附素,C端区域的部分空间结构模型。对模型空间结构的合理性通过Verify-3D程序进行评估,Ramachandram图谱和残基相容性评分结果显示,构建出的模型结构合理,各氨基残基的空间排布整体相容性较高.模型多为β型结构,非球状,本研究可为进一步通过空间结构模型进行特异性抗体、适体的设计以及筛选提供理论基础。

关键词：肠出血性大肠杆菌O157:H7 紧密黏附素免疫原性同源建模

福建省非典型肠致病性大肠杆菌紧密黏附素基因分型分析

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预防医学论坛 2014年第3期20卷 183-185,188页

作者：李曲文陈爱平郑恩惠林杰陈建辉福建省疾病预防控制中心福建福州350001 福建省人兽共患病研究重点实验室福建福州350001

目的了解福建省非典型肠致病性大肠杆菌(aEPEC)分离株紧密黏附素基因(eaeA)型别的分布情况。方法根据eaeA基因3′端的不同,采用18对引物用PCR基因扩增方法,对30株aEPEC分离株的进行紧密黏附素(intimin)基因的扩增。结果分离的30株检出了... 详细信息

目的了解福建省非典型肠致病性大肠杆菌(aEPEC)分离株紧密黏附素基因(eaeA)型别的分布情况。方法根据eaeA基因3′端的不同,采用18对引物用PCR基因扩增方法,对30株aEPEC分离株的进行紧密黏附素(intimin)基因的扩增。结果分离的30株检出了6个紧密黏附素基因型别(eae-α1、β1、δ/κ/β20、η、ε1、θ/γ2),阳检率分别为eae-α13.3%(1)、eae-β1 20%(6)、eae-δ/κ/β20 36.7%(11)、eae-η13.3%(4)、eae-ε1 3.3%(1)、eae-θ/γ2 10%(3)、未分型16.7%(5)。结论福建省aEPEC分离株的紧密黏附素基因型别表现为多态性;eae-δ/κ/β20和eae-β1型别是福建省aEPEC菌株紧密黏附素基因的主要的型别;intimin基因分型在aEPEC暴发事件流行病学调查上具有一定的意义。

关键词：非典型肠致病性大肠杆菌紧密黏附素基因分型

肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密黏附素与受体的研究进展

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微生物学免疫学进展 2008年第2期36卷 70-72页

作者：彭丽娟万成松南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系广州510515

肠出血性大肠杆菌O157∶H7能引起出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征、血小板减少性紫癜等。大肠杆菌O157∶H7的主要毒力因子紧密黏附素由其毒力岛LEE岛上的eae基因编码,C末端的280个氨基酸是受体结合位点。目前发现紧密黏附素受体有紧密... 详细信息

肠出血性大肠杆菌O157∶H7能引起出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征、血小板减少性紫癜等。大肠杆菌O157∶H7的主要毒力因子紧密黏附素由其毒力岛LEE岛上的eae基因编码,C末端的280个氨基酸是受体结合位点。目前发现紧密黏附素受体有紧密黏附素转位受体(Tir)、核仁素和β1整合素。紧密黏附素主要与受体Tir结合,通过Ⅲ型分泌系统转位到宿主细胞,在Tir-细胞骨架偶联蛋白(Tccp)的参与下,与N-Wiskott aldrich综合征蛋白、肌动蛋白-相关蛋白2/3相互作用产生信号级联放大,导致宿主大肠黏膜上产生黏附-抹去损伤。

关键词：肠出血性大肠杆菌O157:H7 紧密黏附素紧密黏附素转位受体核仁素 β1整合素

肠出血性大肠杆菌O157：H7基因工程疫苗免疫小鼠的实验研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2008年第9期28卷 828-832页

作者：程建平邹全明毛旭虎易勇王庆旭马颖徐州医学院附属淮安医院检验科 233002 第三军医大学临床微生物及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心重庆400038

目的研究肠出血性大肠杆菌O157：H7基因工程疫苗免疫小鼠后对该菌感染的保护能力。方法将60只BALB／c小鼠平均分为5组，分别为3种抗原单独免疫、三抗原联合免疫和PBS对照组，用注射方式免疫3次，抗原和佐剂均为每次100μg／只。采集免... 详细信息

目的研究肠出血性大肠杆菌O157：H7基因工程疫苗免疫小鼠后对该菌感染的保护能力。方法将60只BALB／c小鼠平均分为5组，分别为3种抗原单独免疫、三抗原联合免疫和PBS对照组，用注射方式免疫3次，抗原和佐剂均为每次100μg／只。采集免疫前和各次免疫后7d的小鼠血清检测抗体，末次免疫10d后以10^9CFU的O157全菌液经口感染小鼠。观察小鼠临床症状及死亡情况，检测粪便与肠道带菌情况，并作病理组织学检测。结果各抗原免疫组小鼠特异抗体明显增加，感染后各组小鼠均有死亡，IntiminC300、Stx2B、HlyAN436和联合免疫组保护率分别为73％、64％、36％和91％。未病死小鼠粪便排菌情况：对照组22d，实验组为5—14d。肠道带菌情况：对照组阳性率为100％，实验组为25％-83％。病死小鼠肺脏、肝脏均有明显组织病理学改变。结论IntiminC300、Stx2B和HlyAN436疫苗对于O157感染具有一定的预防作用，而联合免疫效果又大于单独免疫。

关键词：肠出血性大肠杆菌O157:H7 紧密黏附素志贺毒素ⅡB亚单位 EHEC溶血素基因工程疫苗

产志贺毒素2k新亚型大肠埃希菌的鉴定及其分子特征分析

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产志贺毒素2k新亚型大肠埃希菌的鉴定及其分子特征分析

作者：杨茜中国疾病预防控制中心

学位级别：硕士

产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC）是一类重要的食源性致病菌,人感染后可引起轻度腹泻、出血性肠炎（hemorrhagic colitis,HC）甚至病死率高的溶血性尿毒综合征（hemolytic uremic syndrome,HUS）... 详细信息

产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC）是一类重要的食源性致病菌,人感染后可引起轻度腹泻、出血性肠炎（hemorrhagic colitis,HC）甚至病死率高的溶血性尿毒综合征（hemolytic uremic syndrome,HUS）。牛羊等反刍动物是STEC主要宿主,人主要经粪-口途径感染。目前已报道的STEC血清型达470多种,其中O157:H7是致病性最强也是最常见的血清型,但近年来由非O157 STEC引起的散发感染和暴发的报道越来越多,由其引发的病例在某些国家超过了 STEC O157:H7。志贺毒素（Shiga toxin,Stx）是STEC最重要的毒力因子,可分为志贺毒素1（Shiga toxin 1,Stx1）和志贺毒素2（Shiga toxin 2,Stx2）两种型别。迄今为止已报道STEC中存在3种Stx1亚型和9种Stx2亚型,不同亚型或亚型组合在宿主特异性及致病性等方面存在差异。目前对Stx1/Stx2亚型的鉴定主要通过基于stx1/stx2基因序列差异建立的亚型特异性PCR方法。我们前期对STEC菌株进行亚型分析时,发现1株stx2阳性菌株STEC388不能用现有PCR方法进行分型。将其与目前已知的不同Stx2亚型的氨基酸代表序列构建系统发生树,结果显示STEC388为一个单独分支,即此菌株携带一种新的Stx2亚型,将其命名为Stx2k。Stx2k与Stx2a-Stx2i的核苷酸序列相似性为62.5%～96.3%,氨基酸序列相似性为72.7%～97.0%。根据stx2k基因特定差异位点,设计了 Stx2k的PCR分型检测引物,对实验室自2009年4月到2017年11月间收集和分离的787株非O157 STEC进行了 Stx2k筛查,发现了另外8株Stx2k-STEC菌株,对这些菌株进行分子特征分析。9株Stx2k-STEC菌株经丝裂霉素C诱导后,对Vero细胞的毒性存在较大差异,但总体上均低于STEC O157:H7暴发菌株Xuzhou21。全基因组测序显示9株STEC菌株基因组大小为4,857,389 bp～5,326,462 bp,可分为 7 种血清型（O8:H19、O48:H21、O100:H19、O159:H16、ONT:H30、022:H8 和 O93:H28）,7 种 MLST 型 ST162、ST155、ST1611、ST3630、ST993、ST446和ST403)。Stx由前噬菌体编码,Stx2k前噬菌体存在4种不同的染色体插入位点:dus、yccA、zur及Ser-tRNA。全基因进化分析显示,Stx2k-STEC菌株与STEC、ETEC及STEC/ETEC杂合型菌株具有较近亲缘关系,提示Stx2k噬菌体具有整合到不同遗传背景大肠埃希菌中的能力。仅志贺毒素并不能引起严重疾病,位于LEE毒力岛上的eae基因（*** attaching and effacing）编码的紧密粘附素（intimin）也在STEC O157:H7的致病性中也发挥重要作用,而非O157 STEC携带eae基因的研究较少。本研究对eae在非O157 STEC菌株中的分布情况及序列多态性进行了分析。735株非O157 STEC菌株中共有70株（9.5%）eae基因阳性菌株,分别分离自不同动物（43株）、腹泻患者（9株）及食品（4株）,其余14株来源不详。通过PCR扩增测序得到了 62条eae基因全长序列,根据序列相似性分为18种不同的基因型,核苷酸序列相似性从86.01%到99.97%不等,其中7种基因型为本研究首次报道。通过对已报道的30种不同eae基因亚型参考序列与本研究获得的18条特异序列构建Neibour-Joining系统发生树,本研究的eae基因可分为5种亚型,即β1、γ1、ε1、ξ3和θ。研究发现eae亚型/基因型与血清型及菌株来源有一定相关性。血清型为O26:H11、O103:H2及O111:H8的菌株与特定的eae亚型相关,分别对应ε1、β1和θ。大部分腹泻患者来源的STEC（7/9,77.8%）携带 eae-β1 亚型,而大部分牛来源的 STEC（23/26,88.5%）携带 eae-ζ3亚型。综上所述,本研究发现和命名了一种新的Stx2k亚型,丰富了 Stx2亚型,进一步强调了 STEC菌株基因组的可塑性,并分析了中国不同来源的非O157 STEC菌株中eae基因的遗传多样性。

关键词：产志贺毒素大肠埃希菌志贺毒素2k 志贺毒素噬菌体紧密黏附素全基因组测序