EHEC0157：H7紧密黏附素及突变体与受体Tir的结合特性研究

作     者：易勇 肖敏 罗萍 樊峥 贾莉萍 魏平 陈兴明 李丹 刘春雷 高峰 王贵华 司少艳 毛旭虎 邹全明 敬华 YI Yong;XIAO Min;LUO Ping;FAN Zheng;JIA Li-ping;WEI Ping;CHEN Xing-ming;LI Dan;LIU Chun-lei;GAO Feng;WANG Gui-hua;SI Shao-yan;MAO Xu-hu;ZOU Quan-ming;JING Hua

作者机构：解放军第306医院检验科北京100101 第三军医大学检验系临床微生物及免疫学教研室 中国科学院微生物研究所分子免疫中心 

出 版 物：《中华微生物学和免疫学杂志》 (Chinese Journal of Microbiology and Immunology)

年 卷 期：2012年第32卷第6期

页      面：525-531页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

基　　金：首都医学发展科研基金(2009-3068) 国家自然科学基金(30770514) 

主　　题：EHEC0157:H7 蛋白质相互作用 紧密黏附素 imiminNgl6Y Tir—IBD 

摘      要：目的表达纯化肠出血性大肠杆菌（EHEC）0157：H7的紧密黏附素（intimin）及突变体intiminN916Y，并构建其转位紧密黏附素受体（translocatedint intin receptor，Tir）结合片段（intiminbinding domain，Tir-IBD），通过BIACore技术检测紧密黏附素及突变体intiminN916Y与***蛋白质相互作用特性的变化，探索特定氨基酸的突变对其黏附结合功能的影响。方法设计引物采用PCR法自EHEC0157：H7基因组扩增Tir—IBD的编码基因tir-~d，TA克隆后构建原核表达质粒pET-21a（＋）-tir—ibd，经测序鉴定后转化最coliBL21（DE3），IPTG诱导表达，PAGE检测。目的蛋白经***亲和纯化后，再用阴离子交换柱ResourceQ和分子筛柱Superdex200进行纯化。同时按包涵体复性后纯化的方案制备紧密黏附素及突变体intiminNgl6Y，将所得高纯度目的蛋白Tir-IBD适当稀释后耦联BIACore3000配套的NTA芯片，在25℃和37℃条件下分别以紧密黏附素及突变体***916Y作为流动相进行BIACore检测。结果EHEC0157：H7基因组扩增出了约270bp的目的片段；原核表达质粒pET-21a（＋）-tir-ibd经酶切及测序鉴定与设计序列一致。转化EcoliBL21（DE3）后IPTG诱导目的蛋白表达率约15％；PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量（肘，）约10x103，破菌后电泳证实目的蛋白为可溶表达。Ni-NTA亲和纯化和阴离子交换纯化效果明显，高纯度的Tir-IBD蛋白耦联NTA芯片，在25℃和37℃条件下对紧密黏附素及突变体intiminN916Y与＇***相互作用的BIACore检测结果显示，intiminN916Y特定氨基酸的突变对其结合能力有明显影响并呈温度依赖性。结论EHEC0157：H7的紧密黏附素、突变体intiminN916Y及Tir-IBD经基因克隆后获得了较好的表达，纯化后获得高纯度的目的蛋白。在此基础上建立了蛋白相互作用的BIACore检测体系，证明intiminN916Y特定氨基酸的突变对其结合能力有明显影响并呈温度依赖性。