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水痘-带状疱疹病毒糖蛋白ge在昆虫细胞中的表达鉴定及其晶体培养

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中国病原生物学杂志 2019年第5期14卷 505-510页

作者：姚巧缤李婷婷荣芮张玉云李泽凯薛文辉李瑾瑾朱瑞程通顾颖夏宁邵李少伟厦门大学生命科学学院国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心福建厦门361102 厦门大学公共卫生学院分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室

目的利用杆状病毒-昆虫表达系统建立纯化水痘带状疱疹病毒(VZV)包膜糖蛋白ge的方法,筛选ge蛋白的晶体培养条件,以期用于结构解析。方法将VZV糖蛋白ge基因序列克隆至杆状表达载体pAcgp67B载体中,利用High FiveTM昆虫细胞表达ge蛋白并进行... 详细信息

目的利用杆状病毒-昆虫表达系统建立纯化水痘带状疱疹病毒(VZV)包膜糖蛋白ge的方法,筛选ge蛋白的晶体培养条件,以期用于结构解析。方法将VZV糖蛋白ge基因序列克隆至杆状表达载体pAcgp67B载体中,利用High FiveTM昆虫细胞表达ge蛋白并进行TALON亲和层析纯化;利用WAVE生物波浪反应器建立含硒代甲硫氨酸的ge蛋白方法,以便在晶体结构解析中利用单波长或多波长异常散射进行相位解析;通过分子排阻色谱、分析超离,差示扫描量热法和酶联免疫吸附试验等分析ge蛋白的理化性质;利用结晶试剂盒对ge498和ge354蛋白的结晶条件进行初筛。结果获得的ge498和ge354蛋白纯度约为90%、产量为8~10 mg/L。理化分析显示两种ge蛋白在溶液中主要以均一稳定的单体形式存在,并呈现出良好的反应原性。在ge354晶体初筛中获得3个结晶条件:CrystalH3、PEGH12和IndexB10。结论建立了VZV糖蛋白ge表达和纯化方法,制备的蛋白纯度高,且具有反应原性,并筛选出CrystalH3、PEGH12和IndexB10这3个结晶条件,为ge糖蛋白的结构与功能研究及新型疫苗开发奠定了基础。

关键词：水痘-带状疱疹病毒糖蛋白ge 杆状病毒-昆虫表达系统晶体培养硒代甲硫氨酸

伪狂犬病毒糖蛋白ge和gI抑制IFN-β产生的机制研究

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伪狂犬病毒糖蛋白gE和gI抑制IFN-β产生的机制研究

作者：陆明青南京农业大学

学位级别：硕士

猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)是感染猪的重要病原之一,能够引起仔猪出现神经症状,母猪流产、产弱仔、死胎,生长猪呼吸道症状给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。2011年以来我国多个省份猪伪狂犬疫苗免疫的猪场出现了伪狂犬... 详细信息

猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)是感染猪的重要病原之一,能够引起仔猪出现神经症状,母猪流产、产弱仔、死胎,生长猪呼吸道症状给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。2011年以来我国多个省份猪伪狂犬疫苗免疫的猪场出现了伪狂犬病毒变异株,使得猪伪狂犬病更加难以控制。本研究首先从河北某发病猪场分离得到一株伪狂犬病毒,命名为PRVHB株,对ge和gC基因序列进行了克隆、测序、比对分析和鉴定实验,表明该毒株是2011年后流行的变异株;然后从病毒逃逸宿主天然免疫的角度出发,探究了其糖蛋白ge和gI抑制cGAS/STING介导的IFN-β产生的分子机制,为PRV的致病机制和防控提供一些理论依据。本研究首先对河北某猪场中疑似猪伪狂犬疾病的送检脑组织样本进行PCR检测,初步鉴定为伪狂犬病毒感染。然后,将病料上清无菌处理后接种Vero细胞,24h后细胞发生变圆、空泡、合胞体等典型的细胞病变,分离的病毒经过三次空斑纯化后经PCR鉴定为PRV,命名为PRV HB株。分离的病毒在Vero细胞上的生长滴度可以达到107.36TCID50/mL。ge和gC的基因进化树结果显示,本次分离的病毒株与2011年之后我国新流行的毒株在一个分支上,ge基因序列与2011年之后流行毒株的同源性99.8-100%之间,gC基因序列与2011年之后流行毒株的同源性在99.9-100%之间。该毒株与2011年之前流行株的ge和gC基因序列比对结果显示,ge有2处连续三个碱基的插入,gC有连续21个碱基的插入。将分离的病毒皮下注射小鼠,3天内,小鼠出现神经症状,嘶咬接种部位,4天内小鼠相继死亡。将分离的病毒对家兔进行肌肉注射,24h后,家兔表现异常亢奋,嘶咬接种部位直至溃烂出血,2天内家兔全部死亡。以上结果表明,本次分离的PRVHB病毒株为2011年之后新流行的变异株。宿主细胞通过模式识别受体侦测进入细胞的病原微生物,通过级联放大机制诱导干扰素的产生。环化鸟苷-腺苷合成酶cGAS是识别细胞质中微生物DNA的主要传感器,其能通过cGAS/STING/IRF3信号传导途径诱导干扰素(IFN)产生,进而诱导抗病毒反应的发生。然而,某些病毒已经进化出多种策略来逃逸这一过程。伪狂犬病病毒(PRV)是双链DNA病毒,属于α-疱疹病毒家族成员。以往研究表明许多疱疹病毒编码的蛋白可抑制Ⅰ型IFN的产生从而有利于自身复制,但PRV逃逸先天性免疫尤其是干扰素反应却知之甚少。在本研究中,我们发现PRV糖蛋白ge能够抑制cGAS/STING介导的IFN产生。ge的过表达降低了 cGAS/STING介导的IFN-β启动子活性和mRNA表达水平,而且表明ge靶向IRF3或IRF3下游来抑制IFN-β的产生。然而,ge并不影响IRF3的磷酸化,二聚化和转运入核。进一步研究发现ge可定位在细胞核膜上,并能够导致CREB结合蛋白(CBP)的降解,蛋白酶体抑制剂MG132阻碍了 CBP降解并恢复由ge抑制的IFN-β启动子的活性。以上这些结果证明PRV ge可通过降解CBP来妨碍IRF3和CBP的结合,进而抑制cGAS/STING介导的IFN-β产生。ge和gI均为I型跨膜蛋白,常以异源二聚体的形式存在,与病毒在神经元的传递有关。在上述实验表明ge通过降解CBP抑制干扰素产生基础上,进一步研究gI是否能抑制干扰素产生。首先gI的过表达降低了 cGAS/STING介导的IFN-β启动子活性和xmRNA表达水平,然后表明gI靶向IRF3或IRF3下游来抑制IFN-β的产生,而且实验结果表明gI并不影响IRF3的磷酸化,但阻碍了 IRF3的二聚化和随后IRF3的转运入核。通过构建gI截短突变体和缺失突变体,发现gI编码的183-274氨基酸片段是抑制cGAS/STING介导的IFN-β产生的主要区域。以上结果表明,gI可通过阻碍IRF3的二聚化来抑制cGAS/STING介导的IFN-β产生。

关键词：伪狂犬病毒糖蛋白ge 糖蛋白gI IFN-β CBP IRF3

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E在昆虫细胞中的表达、鉴定及免疫原性分析

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中国生物工程杂志 2019年第8期39卷 17-24页

作者：齐家龙高瑞雨靳输梅高福兰杨旭马雁冰刘存宝中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所昆明65000 云南省药物研究所云南白药集团创新研发中心云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室昆明65000

目的:利用昆虫-杆状表达系统建立表达和纯化分泌形式的水痘-带状疱疹病毒(varicellazoster virus,VZV)糖蛋白ge的方法,并鉴定其理化性质及免疫原性。方法:利用Gibson assembly同源重组试剂盒快速构建重组质粒pFastbac-VZV ge。在sf9昆... 详细信息

目的:利用昆虫-杆状表达系统建立表达和纯化分泌形式的水痘-带状疱疹病毒(varicellazoster virus,VZV)糖蛋白ge的方法,并鉴定其理化性质及免疫原性。方法:利用Gibson assembly同源重组试剂盒快速构建重组质粒pFastbac-VZV ge。在sf9昆虫细胞中鉴定序列优化前后表达量的差异,并在High Five^TM细胞中大量表达。通过Ni-NTA亲和层析方法得到高纯度ge蛋白,之后通过酶联免疫吸附试验等验证了其理化性质,并进行小鼠免疫分析其免疫原性。结果:构建了pFastbac-VZV ge1/2重组质粒,经过PCR及双酶切鉴定后均为阳性克隆。使用BAC/PAC试剂盒提取Bacmid转染sf9细胞制备杆状病毒,经Western blot检测,sf9细胞开始表达ge蛋白且随着病毒代次升高ge蛋白表达量增加。序列优化后表达量明显增加,但是大部分以胞内形式存在。通过Ni-NTA一步亲和层析获得纯度较高的ge蛋白,并与VZV单抗9C8具有较好的反应性。通过免疫小鼠产生高滴度抗体,且免疫荧光结果显示其血清可以与天然病毒上的ge抗原结合。结论:成功获得了杆状表达系统表达的ge蛋白并且纯化和鉴定了蛋白质的性质及免疫原性,为进一步研发具有自主产权的VZV亚单位疫苗研究奠定了基础。

关键词：水痘带状疱疹病毒糖蛋白ge 昆虫表达系统免疫原性

牛传染性鼻气管炎病毒重组ge蛋白间接ELISA诊断方法的建立

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中国生物工程杂志 2005年第12期25卷 29-33页

作者：王海燕朱远茂薛飞童光志赵立平相文华韩文瑜中国农业科学院哈尔滨兽医研究所吉林大学农学部长春130062

以重组牛传染性鼻气管炎病毒ge蛋白,经纯化后作为诊断抗原建立了检测牛血清特异性ge抗体的间接酶联免疫吸附试验,确定其最佳包被量为每孔1.075μg。样品稀释度为1:40,兔抗牛IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1∶5000。判定标准为样品O... 详细信息

以重组牛传染性鼻气管炎病毒ge蛋白,经纯化后作为诊断抗原建立了检测牛血清特异性ge抗体的间接酶联免疫吸附试验,确定其最佳包被量为每孔1.075μg。样品稀释度为1:40,兔抗牛IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1∶5000。判定标准为样品OD值大于0.582为阳性,小于0.472为阴性,在0.472与0.582之间为可疑。经抗特异性试验和重复性试验证明该方法特异性高、重复性好。在403份血清样品中,进口试剂盒检出234份阳性样品,该诊断方法检出248阳性样品,与进口试剂盒的符合率为94.3%,但该诊断方法检出率更高。在43份血清样品中,中和试验检出24份阳性样品,该诊断方法检出28份阳性样品,与中和试验的符合率为85.7%。应用该诊断方法调查了我国部分地区IBRV的感染率,发现这些地区的IBRV感染率为68.7%。

关键词：牛传染性鼻气管炎牛疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白ge 酶联免疫吸附试验

伪狂犬病毒ge基因主要抗原区的表达及其表达蛋白间接ELISA诊断方法的研究

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伪狂犬病毒gE基因主要抗原区的表达及其表达蛋白间接ELISA诊断方...

作者：樊淑华河南农业大学

学位级别：硕士

(伪狂犬病Pseudorabies，PR)是由α疱疹病毒科的伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PrV)引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是本病毒的天然宿主和贮存者，该病给养猪业造成了巨大的经济损失。预防、控制并最终根除... 详细信息

(伪狂犬病Pseudorabies，PR)是由α疱疹病毒科的伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PrV)引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是本病毒的天然宿主和贮存者，该病给养猪业造成了巨大的经济损失。预防、控制并最终根除该病是我国当前面临的一项艰巨任务。在欧美等发达国家的伪狂犬病根除计划中，多采用ge缺失标记疫苗和相应的ge抗体鉴别诊断方法。同时ge糖蛋白也是PrV的一种十分重要的糖蛋白，在决定病毒的毒力及神经嗜性等方面起着重要作用，但ge不是PrV增殖所必需的蛋白，因此可作为缺失的候选基因。目前我国已研制成功ge基因标记疫苗。为了建立适合我国国情的ge鉴别诊断方法，开展了以下研究。 *** ge基因的主要抗原表位区在大肠杆菌中的表达将伪狂犬病病毒(PrV)MinA株ge基因主要抗原表位区0.63kb的片段融合到原核表达载体pET-28a的T7启动子下游，构建成原核表达质粒，经IPTG诱导，SDS-PAge和Western-blot印迹分析，证实ge基因主要抗原表位区在大肠杆菌中获得了表达，表达产物具有抗原性，分子量为29kD，位于包涵体中。 2．表达蛋白的纯化与复性 MinA株ge基因主要抗原区在pET-28a表达载体中表达产量较高，但是都以包涵体形式存在，必须经过复性才具有生物学活性。收集诱导表达的菌液，超声波破碎分离包涵体，尿素和Triton X-100分别洗涤包涵体，用尿素溶解包涵体，复性液稀释变性蛋白，缓冲液透析获取纯化蛋白。SDS-PAge分析电泳结果表明，尿素和Triton X-100可洗去部分杂蛋白，8mol／L尿素能很好的溶解包涵体，回收率约20％，其纯度可达85％左右。ELISA试验测定的结果显示，与复性前变性蛋白相比，纯化蛋白与PrV阳性血清反应的特异性有明显提高。 ***-ELISA的建立将经纯化、变性、复性等处理后的ge蛋白作为抗原，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG为二抗，建立了检测伪狂犬病毒抗体的间接ELISA方法，并确定了ELISA最佳工作条件：抗原最佳包被浓度为14.5ug／ml，最佳包被时间为37℃ 1h，再4℃过夜;伪狂犬阳性血清(1∶80)在37℃作用1h;二抗(1∶3000)37℃作用1h。通过重复性试验、交叉试验、特异性试验和稳定性试验等试验结果表明该方法重复性好、特异性强、灵敏度高。以该方法检测100份己知背景猪血清，结果表明，该方法诊断特异性为94％，诊断敏感性为96％。以3块不同批次包被抗原的酶标板检测10份血清，结果显示阳性血清的变异系数均小于10％，表明该方法重复性好。对比国外阻断ge-ELISA同时检测80份猪血清，两者符合率为96.3％(77／80)。本研究结果为伪狂犬诊断方法的标准化提供了实验基础，为伪狂犬病的诊断与监测提供一种良好的技术手段。

关键词：伪狂犬病病毒糖蛋白ge 大肠杆菌表达酶联免疫吸附试验

传染性喉气管炎病毒gD、ge、gJ基因的表达与间接ELISA方法的建立

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传染性喉气管炎病毒gD、gE、gJ基因的表达与间接ELISA方法的建立

作者：何来中国农业科学院

学位级别：硕士

禽传染性喉气管炎(Infectious Laryngotracheitis，ILT)是鸡的一种以呼吸困难、咳出血样黏液、喉部和气管黏膜水肿出血并导致糜烂为主要特征的病毒性呼吸道传染病，可致感染鸡的死亡和产蛋下降，是危害养禽业的重要疫病之一。传染性喉... 详细信息

禽传染性喉气管炎(Infectious Laryngotracheitis，ILT)是鸡的一种以呼吸困难、咳出血样黏液、喉部和气管黏膜水肿出血并导致糜烂为主要特征的病毒性呼吸道传染病，可致感染鸡的死亡和产蛋下降，是危害养禽业的重要疫病之一。传染性喉气管炎病毒(ILTV)野毒和弱毒疫苗都可以造成潜伏感染，成为传染源，使本病持续存在，并形成区域流行。本研究通过表达ILTV三个重要结构蛋白并纯化和建立间接ELISA方法，以筛选合适的诊断抗原并建立间接ELlSA方法，用于ILTV野毒感染的血清学检测。本研究首先克隆和测序了ILTV WG株gJ基因，gJ完整开放阅读框大小为2988bp，比ILTVUSDA株多30bp，推测编码的氨基酸序列单独形成一个表位。随后，通过PCR扩增出ILTV三重要囊膜糖蛋白gD、ge和gJ的主要抗原性区域，连接到原核表达载体pET-32a(+)中，经IPTG诱导在*** BL21(DE3)中表达，三重组蛋白r-gD、r-ge和r-gJ都有可溶性蛋白存于上清中，经His单克隆抗体鉴定后，非变性条件下用Ni树脂纯化r-gD、r-ge和r-gJ，ILTV阳性血清和制备的兔抗r-gD、r-ge、r-gJ单因子血清证实r-gD、r-ge和r-gJ都保留了抗原性。然后，对纯化的r-gD、r-ge和r-gJ进行了间接ELISA条件的探索，优化抗原浓度，血清稀释度，酶标二抗稀释倍数和封闭液;根据36份SPF阴性血清，按阴阳性临界值=阴性血清OD平均值+3×SD，确立了r-gD、r-ge和r-gJ间接ELISA判定标准;完成了特异性试验和符合性试验，r-gD、r-ge和r-gJ间接ELISA对139份血清样品的检测结果与全病毒间接ELISA的符合率分别为92.8％、77.0％和77.0％;对试验感染ILTV WG株的SPF鸡血清进行检测，r-gD、r-ge和r-gJ间接ELISA都能检测出明显的抗体变化曲线，其中r-gD间接ELISA能够更合理的反映ILTV感染后机体的体液免疫状况。根据试验结果，我们选择r-gD为ILTV野毒感染的血清抗体检测ELISA抗原，并确立了间接ELISA方法。本研究筛选r-gD为ELISA抗原，确立间接ELISA方法，为ILTV野毒感染与弱毒疫苗免疫的血清检测提供基础。

关键词：传染性喉气管炎病毒糖蛋白gD 糖蛋白ge 糖蛋白gJ 间接ELISA