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黄芩苷对糖氧剥夺诱导内皮细胞凋亡与坏死的保护作用

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黄芩苷对糖氧剥夺诱导内皮细胞凋亡与坏死的保护作用

作者：李世广州中医药大学

学位级别：硕士

随着老年化进程加快,痴呆的患病率急剧上升,相较于我过庞大的人口基数,痴呆逐渐成为我国一个重要的公共健康问题。痴呆主要分为三种类型：阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)、血管性痴呆(vascular dementia,VD)以及混合性痴呆。在... 详细信息

随着老年化进程加快,痴呆的患病率急剧上升,相较于我过庞大的人口基数,痴呆逐渐成为我国一个重要的公共健康问题。痴呆主要分为三种类型：阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)、血管性痴呆(vascular dementia,VD)以及混合性痴呆。在全世界的痴呆患者中,血管性痴呆大约占20%;并且在亚洲患血管性痴呆人数已经超过了阿尔茨海默病患者。血管性痴呆患者的5年生存寿命低于阿尔茨海默病,同时老龄化加快心脑血管疾病成为危害国民健康的第一大问题,对血管性痴呆的研究重要性也越发显现。长期以来,广大科研工作者致力于该疾病的机制及防治研究,虽取得了较大进展,但目前仍缺乏有效干预和防治该疾病的药物或措施。黄芩是一味具有悠久历史的传统中药,能清热解毒,燥湿止血。现代的药理学研究表明黄芩还有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化等多种药理作用。黄芩苷(Baicalin),黄芩根里提取出来的黄酮类化合物,是比较重要的药理活性成分。在许多的研究显示,黄芩苷具有抗氧化、抗炎等作用,能够改善有心肌缺血损害。目的本实验以缺糖缺氧诱导小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3 cell)损害,建立糖氧剥夺模型(oxygen-glucose deprivation, OGD),模拟脑缺血缺氧损害病理。研究黄芩苷对小鼠脑微血管内皮细胞糖氧剥夺诱导凋亡和坏死的保护作用。方法1.构建糖氧剥夺模型(OGD),将贴壁好的内皮细胞,通过置换无糖培养基,放入定制的无氧装置,运用MTT法检测证明模型建立成功与稳定。2.通过MTT法、LDH法证明黄芩苷对糖氧剥夺诱导细胞损害有保护作用;3.通过流式检测方法检测黄芩苷(100 u M)对糖氧剥夺诱导bEnd.3细胞晚期凋亡、坏死的影响4.透射电镜、Hoechst 33258/PI双染法分别观察黄芩苷对糖氧剥夺诱导bEnd.3细胞损害形态改变影响;5.通过ROS测定验证黄芩苷具有抗氧化作用进一步说明黄芩苷对糖氧剥夺诱导细胞损害的保护作用。结果1.OGD模型构建OGD诱导小鼠脑微血管内皮细胞在2、4、6 h损害明显,在2、4、6 h三个时间的细胞存活率的百分数分别为(x±s)：62.31±2.91、48.32±0.49、36.95±6.46,模型组细胞存活率低于对照组比较(p模型组细胞存活率低于正常对照组(p模型组比较,药物对细胞有明显保护作用(p模型组细胞上清液LDH含量增加(p模型组比较,黄芩苷100 u M和200μM组细胞上清LDH漏出量降低(p模型组比较,用药组细胞上清液LDH含量减少明显(p模型组Annexin-V(+/-)/PI(+)ratio增加明显,细胞晚期凋亡和坏死多,(p模型组组比较,黄芩苷组Annexin-V(+/-)/PI(+)明显减少,对细胞晚期凋亡和坏死有减少,对细胞有保护作用,有统计学意义(p糖氧剥夺6 h bEnd.3细胞Hoechst 33258/PI荧光双染检测结果：与正常组比较,模型组同时染上两种染料的细胞明显多,表示坏死和晚期凋亡细胞增加;与模型组比较,黄芩苷100μM组细胞双染少,坏死和晚期凋亡细胞少。糖氧剥夺诱导2、4、6 h以及黄芩苷对bEnd.3细胞形态改变实验结果：糖氧剥夺损害2、4、6 h,2、4 h细胞空泡逐渐增多,存在凋亡;6 h细胞质融解,核碎裂细胞坏死。加入黄芩苷100μM细胞形态：细胞膜、细胞核、细胞器完整,与OGD损害6 h比较,细胞形态比较完整,黄芩苷保护作用较明显。5.黄芩苷对OGD诱导6 h bEnd.3细胞内ROS含量结果：OGD 6 h模型组组与正常组比较,ROS含量增加明显;黄芩苷100μM组与模型组比较细胞内ROS产生明显减少。结论1.OGD诱导bEnd.3细胞损害明显,且细胞损害程度随时间增加而损害增加的趋势,OGD诱导损害模型稳定,能达到预期实验损害要求2.黄芩苷能明显减少糖氧剥夺诱导bEnd.3细胞损害的作用,保护作用没有明显的药物剂量依赖的现象。同时能减少细胞上清液中LDH的含量,并且黄芩苷对减少细胞上清液中LDH的含量在糖氧剥夺诱导6 h作用最明显。3.黄芩苷能明显减少糖氧剥夺诱导bEnd.3细胞晚期凋亡和坏死。4.黄芩苷能减少糖氧剥夺诱导bEnd.3细胞坏死,维持细胞生理结构的稳定。5.黄芩苷能

关键词：血管性痴呆糖氧剥夺模型黄芩苷凋亡坏死

SD大鼠少突胶质前体细胞的纯化及氧糖剥夺对其活性的影响

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东南大学学报（医学版） 2019年第4期38卷 572-578页

作者：莫思思朱丽华李棒棒疏佳萍乔立兴东南大学医学院江苏南京210009 江苏卫生健康职业学院江苏南京210029 皖南医学院第一附属医院/戈矶山医院安徽芜湖241001 东南大学附属中大医院江苏南京210009

目的:纯化少突胶质前体细胞,并探讨氧糖剥夺不同时间对其活力的影响。方法:取SD乳鼠的脑皮质,采用差速贴壁、振荡分离纯化、限定培养基定向培养法,获取少突胶质前体细胞。镜下观察少突胶质前体细胞分化过程中各阶段细胞的形态变化。采... 详细信息

目的:纯化少突胶质前体细胞,并探讨氧糖剥夺不同时间对其活力的影响。方法:取SD乳鼠的脑皮质,采用差速贴壁、振荡分离纯化、限定培养基定向培养法,获取少突胶质前体细胞。镜下观察少突胶质前体细胞分化过程中各阶段细胞的形态变化。采用特异性抗体A2B5、MBP、GFAP、IBA - 1标记纯化后少突胶质前体细胞、成熟少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞所占比例,以此分析纯化后的细胞纯度。体外制备细胞氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)模型,采用CCK - 8法观察其对少突胶质细胞系增殖活性的影响。结果:(1)利用针对少突胶质前体细胞、成熟少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞的特异性抗体A2B5、MBP、GFAP和IGB - 1进行标记,A2B5、MBP染色阳性细胞分别占96.2%、2.1%,GFAP和IBA - 1染色阳性细胞小于3%。(2) MTT检测显示,随着OGD干预时间的延长,细胞活力呈降低的趋势。结论:(1)联合应用差速贴壁、恒温振荡分离和条件限定培养基可以获得高纯度的少突胶质前体细胞;(2)干预 3 h 适宜用于体外少突胶质前体细胞的OGD模型。体外建立的OGD模型可导致少突胶质前体细胞的损伤,使其细胞活性下降。

关键词：少突胶质前体细胞细胞纯化糖氧剥夺模型 SD大鼠

大鼠星形胶质细胞糖氧剥夺后AQP4表达变化及1,5-DCQA干预作用

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大鼠星形胶质细胞糖氧剥夺后AQP4表达变化及1,5-DCQA干预作用

作者：黄鹤鸣暨南大学

学位级别：硕士

背景：缺血性卒中是常见病、多发病，其致死率、致残率都很高，而脑水肿是伴随该病的一个重要的病理过程，严重影响着预后。水通道蛋白的发现使人们认识到水的跨膜转运不仅仅是通过简单扩散透过磷脂膜，在病理情况下还有一种更重要的方... 详细信息

背景：缺血性卒中是常见病、多发病，其致死率、致残率都很高，而脑水肿是伴随该病的一个重要的病理过程，严重影响着预后。水通道蛋白的发现使人们认识到水的跨膜转运不仅仅是通过简单扩散透过磷脂膜，在病理情况下还有一种更重要的方式就是特异性水通道蛋白介导的快速水转运。其中水通道蛋白4，AQP4（Aquaporin-4）主要分布在中枢神经系统，尤其是与水代谢密切相关区域的星形胶质细胞。因此，研究缺血缺氧下星形胶质细胞AQP4表达的变化及1,5-二咖啡酰奎宁酸对其表达变化的影响，以期对临床治疗缺血性卒中提供新的思路。目的：应用改良的能模拟缺血缺氧中心区损伤的糖氧剥夺模型,观察星形胶质细胞表达AQP4的变化及探讨1,5-二咖啡酰奎宁酸对星形胶质细胞缺血损伤的干预作用。方法：采用能模拟缺血缺氧中心区星形胶质细胞损伤的糖氧剥夺模型，观察不同糖氧剥夺时间星形胶质细胞的存活率及AQP4表达情况。在此基础上，实验分对照组及1,5-二咖啡酰奎宁酸预处理组，比较两组细胞在不同糖氧剥夺时间下的HE染色形态学变化，细胞存活率、膜损伤细胞的比例、LDH漏出率及AQP4的表达量的变化。结果:星形胶质细胞经糖氧剥夺损伤后，细胞存活率逐渐下降，而膜损伤细胞的比例、LDH漏出率及AQP4表达随着糖氧剥夺时间的延长而增加。1,5-二咖啡酰奎宁酸预处理可以显著提高星形胶质细胞存活率，降低膜损伤细胞的比例及LDH漏出率，并抑制AQP4表达。结论：1,5-二咖啡酰奎宁酸预处理能明显减轻糖氧剥夺导致的星形胶质细胞损伤，其可能通过减少AQP4的表达,抑制星形胶质细胞胀亡途径达到保护作用。

关键词：糖氧剥夺模型星形胶质细胞水通道蛋白4 胀亡 1,5-二咖啡酰奎宁酸

药效导向的芪参益气滴丸活性成分生物药剂学属性影响机制研究

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药效导向的芪参益气滴丸活性成分生物药剂学属性影响机制研究

作者：龚燚婷北京中医药大学

学位级别：硕士

目的:生物药剂学分类系统(BCS)是一种根据药物的水溶解性及肠渗透性高低对药物进行分类的一种科学方法,可预测药物在体内药代动力学性能,建立体内外相关联系,并以此为依据用于指导早期的药物设计、新药开发以及仿制药一致性评价,已成为... 详细信息

目的:生物药剂学分类系统(BCS)是一种根据药物的水溶解性及肠渗透性高低对药物进行分类的一种科学方法,可预测药物在体内药代动力学性能,建立体内外相关联系,并以此为依据用于指导早期的药物设计、新药开发以及仿制药一致性评价,已成为化药的基础研究及应用性药物研发各阶段中的重要工具。然而,与化药的单成分环境不同,中药具备多成分的特点,成分间的相互作用极可能影响活性成分的水溶解性及肠渗透性进而影响药效。因此,借鉴BCS理论基础,以吸收为核心,准确评价复方环境下活性成分水溶解性和肠渗透性及影响机制,建立中药生物药剂学分类系统(CMMBCS),有利于实际指导中成药制剂的剂型设计与改进,简化中药新药及仿制药的药效一致性评价,提高制剂的研发与利用。目前,CMMBCS研究仍存在两个研究瓶颈,一是中药具备多成分多药效的特征,如何准确筛选能够代表复方药效的活性成分;二是如何找到复方环境下活性成分BCS属性的变化规律及机制。鉴于临床药效是中药有效性评价的核心指标,本研究从中药复方药效出发,以药效为导向,建立“筛选-验证”相结合的活性成分研究模式,获取基于特定药效的复方活性成分,并在此基础上开CMMBCS研究,初步分析及探讨其在不同环境下溶解度与渗透性的变化规律及影响因素。为遵循从简至繁的研究思路,本研究初步选择临床上具有明确药效的芪参益气滴丸作为研究载体。方法:通过文献收集芪参益气滴丸的入血成分,基于网络药理学构建“成分靶点-疾病蛋白”网络,获得复方产生抗心肌缺血药效的关键靶点和特征通路,并以此为依据获得抗心肌缺血潜在活性成分;建立芪参益气滴丸潜在活性成分定量检测分析方法,获得潜在活性成分在复方中的含量关系;建立H9C2心肌细胞糖氧剥夺(OGD)模型,以细胞活力为指标并综合考虑其成分结构特征、文献研究频次、含量、药典记载,明确复方抗心肌缺血活性成分;以细胞活力、LDH活力、CK活力为指标,综合评价混合药液对复方药效的等效性;通过经典摇瓶法和在体单向肠灌流法分别测定芪参益气滴丸活性成分在不同环境和不同介质中的溶解度、有效渗透系数;分析其在不同环境下参数的变化规律,并探讨主要影响因素。结果:(1)通过文献共收集芪参益气滴丸中18个入血成分,利用TCMSP、Swiss target prediction、OMIM等数据库收集了 407个成分靶点和672个疾病蛋白,利用String数据库结合Cytoscape软件构建“成分靶点-疾病蛋白”PPI网络,以Degree、Betweenness、Closeness值为筛选条件获得了 82个特征靶点,发现复方主要通过调节机体的一氧化氮生物合成、细胞凋亡、炎症反应、血管生成等多种生物功能,进而达到保护心肌细胞的作用,其中ALB、TNF、TP53、AKT1以及VEGFA是芪参益气滴丸药效网络中的关键靶点。利用David数据库重新对单味药材进行KEGG通路富集分析,发现低氧应激通路HIF-1信号通路是黄芪、丹参、三七的共同信号通路能在低氧下能迅速被激活以保护心肌细胞。最终以“成分靶点-疾病蛋白PPI网络”和特征通路HIF-1信号通路的调控靶点为依据,初步确认芪参益气滴丸的潜在活性成分为黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷、丹参素、迷迭香酸、原儿茶酸、隐丹参酮、丹参酮ⅡA、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、反式-橙花叔醇。(2)建立了芪参益气滴丸中12个潜在活性成分含量测定方法(3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷、隐丹参酮未检测到),对天士力集团1 1批不同批次的芪参益气滴丸进行含量测定,发现黄芪甲苷、丹参素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、反式-橙花叔醇为复方中的高含量成分(x>1mg),原儿茶酸、芒柄花素、丹参酮ⅡA则是复方中的微量成分(无氧液和三气培养箱,在5%CO2,94.2%N2,0.8%O2条件下成功建立了 H9C2心肌细胞OGD模型;依据细胞活性结果,综合考虑成分结构特征、文献研究频次、含量、药典记载,最终选择丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、芒柄花素、人参皂苷Rg1、黄芪甲苷、丹参酮ⅡA、反式-橙花叔醇作为复方抗心肌缺血活性成分;制备低、中、高三种浓度的八成分混合培养液和芪参益气滴丸复方培养液,以细胞活力、LDH活力、CK活力为指标评价此8种成分对芪参益气滴丸药效的等效性,结果表明相同浓度下混合培养液和复方培养液相比药效接近,基本无显著性差异,说明上述八种成分可作为芪参益气滴丸抗心肌缺血活性成分,进行后续的生物药剂学研究。(4)采用夹角余弦法分析对比单成分环境和复方环境下丹参素、原儿茶醛

关键词：芪参益气滴丸糖氧剥夺模型网络药理学心肌缺血中药生物药剂学分类系统

缺血缺氧中心区星形胶质细胞死亡方式与钠钾ATP酶活性及NKCC1表达的关系

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华中科技大学学报（医学版） 2015年第3期44卷 268-272页

作者：卢艺褚晓凡黄巧英曹旭邹良玉张莹深圳市人民医院神经内科深圳518000

目的通过改良的糖氧剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)模型,探讨缺血缺氧中心区星形胶质细胞损伤后的细胞死亡途径与细胞膜损伤中钠钾ATP酶(Na+-K+-ATPase)活性及钠-钾-氯共转运体1(Na+-K+-2Cl--cotransporter 1,NKCC1)表达的关系... 详细信息

目的通过改良的糖氧剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)模型,探讨缺血缺氧中心区星形胶质细胞损伤后的细胞死亡途径与细胞膜损伤中钠钾ATP酶(Na+-K+-ATPase)活性及钠-钾-氯共转运体1(Na+-K+-2Cl--cotransporter 1,NKCC1)表达的关系。方法取出生24h内的SD大鼠海马星形胶质细胞进行体外培养,鉴定其纯度,应用改良的OGD模型,将星形胶质细胞进行OGD(0、1、2、3、4、6h)处理后检测不同时间点细胞的胀亡率、凋亡率、ATP含量、钠钾ATP酶的活性及NKCC1的表达水平。结果星形胶质细胞存活率随OGD时间的延长而降低,OGD 3h后胀亡细胞率超过凋亡细胞率。ATP含量和钠钾ATP酶活性随OGD时间的延长而下降,NKCC1的表达随着OGD时间的延长先增加后减少,在OGD 3h后明显减少。结论缺血缺氧中心区星形胶质细胞死亡在OGD 3h内以凋亡为主,OGD3h后胀亡是细胞死亡的主要方式,这种转化或许与Na+,K+-ATPase活性及NKCC1表达的激活有关。

关键词：星形胶质细胞糖氧剥夺模型胀亡钠钾ATP酶钠-钾-氯共转运体1

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四氢小檗碱改善血管内皮细胞损伤的研究

海南医学院学报 2020年第15期26卷 1146-1151,1158页

作者：方星悦刘启兵杨潇易国辉樊好飞黄静海南医学院基础医学与生命科学学院海南医学院第一附属医院海南医学院科学实验中心海南海口571199

目的:采用四氢小檗碱(tetrahydroberberine,THB)作用于模拟脑缺血再灌注损伤的糖氧剥夺模型(oxygen glucose deprivation,OGD)和脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导血管内皮细胞损伤模型,探讨其对血管内皮细胞损伤的干预作用。方法:采... 详细信息

目的:采用四氢小檗碱(tetrahydroberberine,THB)作用于模拟脑缺血再灌注损伤的糖氧剥夺模型(oxygen glucose deprivation,OGD)和脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导血管内皮细胞损伤模型,探讨其对血管内皮细胞损伤的干预作用。方法:采用MTT比色法检测THB终浓度分别为0、2.5、5、10、20、40μg/mL对EA.hy926细胞存活率的影响。实验第I小组分组:正常对照组、OGD组、OGD+THB-10μg/mL组、OGD+THB-20μg/mL组、OGD+THB-40μg/mL组;实验第Ⅱ小组分组:正常对照组、LPS组、OGD+LPS组以及OGD+LPS+THB-20μg/mL组。通过荧光定量PCR检测实验I、Ⅱ处理小组的炎症相关因子如Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-6等基因的相对表达量,同时Western Blot分析检测IL-1β、HO-1蛋白表达量。结果:MTT法结果表明四氢小檗碱对EA.hy926细胞存活无影响即不存在细胞毒性。实验I、Ⅱ处理小组的qPCR结果显示,OGD模型能明显通过下调Caspase-1、ASC、IL-1β与IL-6基因的表达发挥抗炎的应激保护作用;THB对于OGD模型的抗炎效果一般,但通过OGD+LPS组与OGD+LPS+THB-20μg/mL组对比发现THB也是通过下调炎症基因表达发挥抗炎效果的。Western Blot分析检测IL-1β蛋白表达量与qPCR结果一致,HO-1蛋白作为保护因子表达量与炎症因子荧光定量结果相反。结论:OGD模型可以提高细胞应激保护作用,四氢小檗碱通过下调Caspase-1、ASC、IL-1β与IL-6基因的表达,上调HO-1蛋白表达,抑制NLRP3炎症小体的活化发挥抗炎的作用。

关键词：四氢小檗碱糖氧剥夺模型脂多糖应激保护

沙库巴曲缬沙坦对缺氧心肌细胞线粒体动力系统和细胞凋亡的影响

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中华老年多器官疾病杂志 2024年第3期23卷 217-222页

作者：沈建张昕焦阳宿永康李影周伯宁沈明志付振虹解放军医学院北京100853 通州离职干部休养所门诊部北京101149 中国人民解放军总医院海南医院心血管内科海南三亚572013

目的验证沙库巴曲缬沙坦(S/V)能否通过调节线粒体动力系统改善缺氧大鼠胚胎心肌细胞(H9c2)凋亡水平,发挥心脏保护作用。方法培养H9c2心肌细胞,建立糖氧剥夺模型(OGD),将细胞分为对照组、造模组、药物组。对照组正常培养心肌细胞,造模组... 详细信息

目的验证沙库巴曲缬沙坦(S/V)能否通过调节线粒体动力系统改善缺氧大鼠胚胎心肌细胞(H9c2)凋亡水平,发挥心脏保护作用。方法培养H9c2心肌细胞,建立糖氧剥夺模型(OGD),将细胞分为对照组、造模组、药物组。对照组正常培养心肌细胞,造模组采用OGD建模,药物组采用OGD建模后加用S/V 20μmol/L干预处理,每组重复5遍。采用流式细胞术检测细胞凋亡及活性氧(ROS),JC-1检测线粒体膜电位,蛋白质免疫印迹法(WB)检测线粒体融合蛋白1(Mfn1)、线粒体融合蛋白2(Mfn2)、动力相关蛋白1(Drp1)、线粒体分裂蛋白1(Fis1)、细胞色素C(CytC)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2关联X蛋白(Bax)及含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)表达情况。采用GraphPad Prism 8统计软件进行数据分析,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。结果H9c2心肌细胞建立OGD模型,经S/V处理后,光镜下心肌细胞形态学明显改善;流式细胞技术分析结果显示S/V明显降低细胞内ROS水平,抑制心肌细胞凋亡(P<0.05);荧光显微镜分析结果显示S/V明显改善线粒体膜电位水平(P<0.05);WB结果显示S/V可明显提升Mfn2、Mfn1、Bcl2蛋白表达水平,降低Drp1、Fis1、CytC、Bax及Caspase-3蛋白表达水平(P<0.05)。结论S/V可能通过促进线粒体融合、抑制线粒体分裂调节线粒体稳态,减少ROS生成,减轻心肌细胞凋亡。

关键词：心肌细胞糖氧剥夺模型沙库巴曲缬沙坦线粒体损伤