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一种改良原代海马神经元糖氧剥夺/复氧模型的建立

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中国生物制品学杂志 2024年第4期37卷 471-474,480页

作者：史晋朝马娜张倩陈静钟锦周阳李建国山西医科大学细胞生理学教育部重点实验室山西太原030001

目的建立一种改良的原代海马神经元糖氧剥夺/复氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型。方法从SD乳鼠脑组织中分离海马组织,制备海马神经元悬液,通过抑制胶质细胞数量,将海马神经元悬液分为无抑制、部分抑制和完全... 详细信息

目的建立一种改良的原代海马神经元糖氧剥夺/复氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型。方法从SD乳鼠脑组织中分离海马组织,制备海马神经元悬液,通过抑制胶质细胞数量,将海马神经元悬液分为无抑制、部分抑制和完全抑制组,经镜下观察细胞形态,确定原代海马神经元的最佳培养条件。在此基础上,将海马神经元进行糖氧剥夺0.5、1和1.5 h,再分别复氧0、24、36和48 h,ELISA法检测培养液中乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)含量,CCK-8法测定神经元存活率,以LDH含量较高,对神经元存活率影响较小的条件为原代海马神经元OGD/R模型的最佳建模条件。结果部分抑制胶质细胞时,神经元纯度较高,生长状态均一良好,胶质细胞与海马神经元数量比约1∶1,可保留胶质细胞与神经元间的结构和功能联系。与OGD 1 h组比较,OGD 1 h/R 36 h时,LDH含量显著升高(t=4.31,P 0.05)。结论获得了胶质细胞与神经元数量约为1∶1的原代海马神经元,且生长状态良好。OGD 1 h/R 36 h条件下建立的OGD/R模型,神经元树突缩短,活力受损,存活率较高。本研究为后续相关疾病的发病机制深入研究奠定了基础。

关键词：海马神经元原代糖氧剥夺/复氧模型乳酸脱氢酶细胞存活率

体外培养大鼠海马神经元糖氧剥夺/复氧轴突损伤模型的建立

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第三军医大学学报 2009年第9期31卷 791-793页

作者：殷成秦新月吴小慧重庆医科大学附属第一医院神经内科重庆市神经病学重点实验室重庆400016

目的建立体外培养大鼠海马神经元糖氧剥夺/复氧轴突损伤模型。方法取体外培养7d的海马神经元,分为正常对照组和糖氧剥夺/复氧组。后者分别在糖氧剥夺0.5、1.0、1.5h再复糖复氧。常氧状态下检测各组复氧后1、5、24、48、72h培养液中的LD... 详细信息

目的建立体外培养大鼠海马神经元糖氧剥夺/复氧轴突损伤模型。方法取体外培养7d的海马神经元,分为正常对照组和糖氧剥夺/复氧组。后者分别在糖氧剥夺0.5、1.0、1.5h再复糖复氧。常氧状态下检测各组复氧后1、5、24、48、72h培养液中的LDH活性,并观察神经元形态和轴突长度的变化。结果糖氧剥夺/复氧后的神经元折光性降低,胞体肿胀,并且轴突逐渐变短,同时LDH水平随时间延长增加。其中糖氧剥夺0.5h再复氧组效果最佳,其轴突缩短明显且神经元存活率较高。结论成功建立了体外培养SD大鼠海马神经元糖氧剥夺/复氧轴突损伤模型。

关键词：糖氧剥夺/复氧模型海马神经元体外培养轴突

14,15-环氧化二十碳三烯酸对糖氧剥夺/复氧诱导的BV2细胞炎症反应的影响

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医药导报 2017年第8期36卷 857-861页

作者：王娟田浩谢敏杰刘璐华中科技大学同济医学院附属同济医院神经科武汉430030 华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部武汉430030

目的观察14,15-环氧化二十碳三烯酸(14,15-EET)对糖氧剥夺/复氧(OGD/R)诱导的BV2小鼠小胶质细胞炎症反应的影响。方法将BV2细胞随机分为空白对照组、溶剂对照组及14,15-EET干预组。在14,15-EET的干预作用下,利用酶联免疫吸附测定(ELISA... 详细信息

目的观察14,15-环氧化二十碳三烯酸(14,15-EET)对糖氧剥夺/复氧(OGD/R)诱导的BV2小鼠小胶质细胞炎症反应的影响。方法将BV2细胞随机分为空白对照组、溶剂对照组及14,15-EET干预组。在14,15-EET的干预作用下,利用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定BV2细胞OGD1h后复糖复氧0,3,6,12,24 h时细胞培养液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度;并用噻唑蓝(MTT)实验检测其各时间点细胞活性的改变。同样条件下,Transwell细胞迁移实验用来观察BV2细胞的迁移能力变化。结果与溶剂对照组比较,14,15-EET干预组BV2细胞培养液中分泌的炎症因子浓度显著减少;细胞活性明显降低;迁移能力显著减弱。以上结果均以OGD1h/R12h最具统计学意义。结论 14,15-EET对BV2细胞OGD再灌注损伤后的炎症反应具有一定的抑制作用。

关键词： 14,15-环氧化二十碳三烯酸 BV2细胞糖氧剥夺/复氧模型炎症反应

编码大鼠RGMa的shRNA真核表达载体构建及其干扰效率的筛选鉴定

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编码大鼠RGMa的shRNA真核表达载体构建及其干扰效率的筛选鉴定

作者：殷成重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:中枢神经系统神经元缺血缺氧损伤后再生极其困难,但近年研究表明,神经元轴突在遭受缺血缺氧或机械损害后却可以在干预因素下再生[1,2],同时再生的轴突促使原受损轴突支配区域的功能恢复。鉴于离体细胞模型能更好的反映神经元轴突... 详细信息

目的:中枢神经系统神经元缺血缺氧损伤后再生极其困难,但近年研究表明,神经元轴突在遭受缺血缺氧或机械损害后却可以在干预因素下再生[1,2],同时再生的轴突促使原受损轴突支配区域的功能恢复。鉴于离体细胞模型能更好的反映神经元轴突的形态变化并便于研究者描述[3],因此为了更好的观察神经元轴突的受损和干预后的再生状态,建立准确有效的轴突模型显得必要。本研究利用无血清培养基体外培养[4]SD乳鼠海马神经元为基础,建立轴突糖氧剥夺/复氧模型,为神经元糖氧剥夺/复氧后损伤及轴突再生的研究提供实验依据。方法:1.海马神经元培养无菌条件下取出生后24 h内的乳鼠大脑海马,使用巴氏管和340目筛网吹打及过滤,制备细胞悬液,接种于细胞培养板中[5]。在37℃、5%的二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)中培养,2.神经元鉴定及纯度检测海马神经元培养6 d后,NSE单克隆抗体免疫组化染色鉴定神经元。阴性对照用0.01 mol/L PBS代替一抗。镜下观察,阳性细胞胞浆内有棕黄色颗粒沉着。3.原代神经元糖氧剥夺/复氧损伤模型制备[6]神经元以24孔培养板培养,实验分为正常对照组、糖氧剥夺/复氧组。正常对照组在常规条件下继续培养;糖氧剥夺/复氧组分别为糖氧剥夺0.5、1.0、1.5 h后再复氧。制备模型前以平衡盐缓冲液冲洗数次,使葡萄糖终浓度小于1 mmol/ml。每孔加入100 ml无糖D-Hanks液,放人缺氧盒内,持续缓慢通人含有95% N2、5% CO2的混合气体分别0.5、1.0、1.5 h,取出并吸弃平衡盐缓冲液,换以完全培养基孵育,置人CO2培养箱孵育。4.乳酸脱氢酶(LDH)的测定于不同时间点收集各组神经元的培养液,使用LDH试剂盒进行乳酸脱氢酶检测,使用550型全自动酶标仪(美国BioRad公司)。在波长440 nm处检测各管吸光度。结果:1.神经元生长及鉴定使用倒置相差显微镜观察,接种初期海马神经元呈圆形, 3～4 d细胞有明显增长的突起并相互连接形成稀疏的网络, 6 d神经元细胞体进一步增大,突起增粗增长,连接成网,细胞体突起光晕明显,立体感及折光性强。第6天的细胞,NSE免疫组化染色(DAB),细胞被染成棕褐色为阳性,不被染色的为阴性细胞。2.糖氧剥夺/复氧对海马神经元存活率以及LDH的影响,与正常对照组细胞比较,糖氧剥夺/复氧3组细胞培养液中LDH活力均升高且有统计学意义(P糖氧剥夺/复氧3组细胞之间,糖氧剥夺0.5 h后复氧,糖氧剥夺1.0 h后复氧和糖氧剥夺1.5 h后复氧,培养液LDH亦值有统计学意义(P糖氧剥夺/复氧对海马神经元轴突长度的影响在不同时间点观察3组糖氧剥夺/复氧神经元的生存状况,发现糖氧剥夺0.5 h复氧后,神经元存活率较高,同时轴突有变短尚未完全消失。其中轴突长度随复氧时间延长而缩短,使用Image-Pro Plus 6.0统计轴突长度,其中正常神经元,糖氧剥夺0.5h,糖氧剥夺0.5h/复氧1h,糖氧剥夺0.5h/复氧5h,糖氧剥夺0.5h/复氧24h轴突长度分别76.27±19.63,70.34±12.30,65.97±16.91,61.48±9.37,57.73±16.74(um),且各组之间轴突长度比较有统计学意义(P糖氧剥夺/复氧模型的建立过程中,发现糖氧剥夺0.5 h再复氧后,神经元存活率较高,同时轴突有变短尚未完全消失,由此显示成功了建立神经元的轴突糖氧剥夺模型。目的RGMa为一种膜蛋白,能特异性的与其受体Neogenin结合,激活下游的Rho kinas途径使神经元生长锥崩解,从而抑制了受损轴突的再生。目前已报道使用RGMa蛋白抗体干预RGMa功能从而达到促进受损后轴突再生的目的,而RNA干扰技术能在在基因水平上降解编码RGMa蛋白的mRNA,降低其蛋白的翻译从而达到阻断RGMa-Neogenin途径。本研究中,在离体细胞模型上面,使用RNA干扰技术,检测RNAi对RGMa蛋白表达的影响,并筛选出最佳沉默效率的RNAi片段,为后继的在体动物实验打下基础。方法1.表达RGMa-shRNA质粒设计、构建和酶切鉴定根据GenBank中RGMa的核苷酸序列(No. NM01107524)和shRNA设计原则,运用RNA设计软件设计3对shRNA将化学合成的正义链和反义链加热到94摄氏度退火获得上游形成BamHI位点、下游形成HindlII位点的双链DNA片段形成双链的siRNA表达模板。以BamHl、HindlII双酶切质粒载体pgensil线性化,琼脂糖凝胶回收试剂盒回收酶切片段。将退火获得的双链DNA片段和酶切载体在T4 DNA连接酶作用下,4摄氏度过夜连接。取5ul连接产物热休克法转化入感受态大肠杆菌DH 5a,均匀涂抹在含3

关键词：糖氧剥夺/复氧模型海马神经元体外培养轴突 RNAi 质粒转染 PC12

羟基红花黄色素A配伍远志皂苷元改善脑缺血损伤的作用机制研究

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羟基红花黄色素A配伍远志皂苷元改善脑缺血损伤的作用机制研究

作者：张成华东师范大学

学位级别：硕士

近年来,缺血性脑卒中的发病率升高并呈现年轻化的趋势,成为最具威胁人类健康的疾病之一。本课题针对缺血性脑卒中开展基于中药活性成份的药理学研究,我们前期研究结果发现,羟基红花黄色素A（Hydroxysafflor yellow A,HSYA）在8mg/kg、16... 详细信息

近年来,缺血性脑卒中的发病率升高并呈现年轻化的趋势,成为最具威胁人类健康的疾病之一。本课题针对缺血性脑卒中开展基于中药活性成份的药理学研究,我们前期研究结果发现,羟基红花黄色素A（Hydroxysafflor yellow A,HSYA）在8mg/kg、16mg/kg浓度下对脑缺血损伤有较好治疗效果,但在16mg/kg剂量下不良反应多,4mg/kg剂量下疗效不明显。因此,我们结合临床上红花或远志的复方疗效研究,依据中医“痰瘀同治”理论,选择并研究化痰药远志皂苷元（Tenuigenin,TEN）单体配伍活血化瘀药HSYA单体对缺血性脑卒中的药理作用及其作用机制。研究采用线栓阻塞大脑中动脉（MCAO）大鼠模型、糖氧剥夺/复氧（OGD/R）细胞模型,通过行为学、分子生物学等多种实验手段,从体内体外不同层面研究HSYA与TEN联合用药对于脑缺血损伤的改善作用,发现两药配伍药效明显优于HSYA或TEN单独用药的疗效。因脑缺血/再灌注（Ischemia/reperfusion,I/R）会引起强烈的炎症反应,我们将HSYA或TEN的作用机制研究集中在炎症相关的JAK2/STAT3/SOCS3信号通路,并通过基因沉默等手段探究两中药单体的可能药靶。主要实验结果如下:***配伍TEN治疗脑缺血损伤的药效学及其通路研究体内实验部分,我们构建大鼠MCAO模型以模拟临床脑缺血损伤,并优化模型以提高模型稳定性、降低术后死亡率,缺血90分钟/再灌注90分钟（时间窗:3小时）后经颈动脉给药。采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）、苏木精-伊红（HE）等染色实验评估模型稳定性并根据Longa评分标准筛选出合适的大鼠模型用于后续实验。通过TTC染色、脑组织含水量测定、尼氏染色、行为学（神经功能评分、旷场实验、被动回避实验）评估HSYA、TEN单独用药和配伍的药效,包括病灶改变、神经元形态变化、肢体运动和学习认知改善。通过蛋白免疫印迹（Western blotting）实验检测给药后炎症相关信号通路上的蛋白变化。实验结果表明:1)优化的MCAO模型在稳定性和死亡率方面控制较好,能进行后续实验并供研究者参考。2)HSYA、TEN能降低缺血病灶体积、降低脑组织含水量、改善神经元形态、改善肢体运动和学习认知能力,并且配伍组药效优于单独用药组。3)HSYA、TEN抑制JAK2/STAT3信号通路激活,促进SOCS3表达,且配伍组蛋白变化更明显。***配伍TEN改善OGD/R模型损伤的细胞保护作用及其分子机制研究体外实验部分,我们构建SH-SY5Y细胞OGD/R模型以模拟脑缺血/再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI）。通过CCK8实验检测HSYA、TEN在不同浓度对OGD/R模型细胞活力的影响,并确定后续实验的药物浓度。通过TUNEL实验,研究各用药组对于细胞凋亡的影响。通过酶联免疫吸附实验测定促炎因子IL-6,研究各用药组对细胞炎症反应的影响。通过沉默SOCS3研究各单独用药组细胞活力的变化。通过在线工具预测HSYA的药物靶点。通过Western blotting测定各用药组炎症相关通路上的蛋白变化以及干扰SOCS3后TEN用药组的蛋白变化。实验结果表明:1)HSYA、TEN能够改善OGD/R模型的细胞活力,抑制炎症反应,减少细胞凋亡,且配伍组药效优于单独用药组。2)HSYA可能通过过度激活JAK2磷酸化,引起下游SOCS3负反馈,抑制炎症相关信号通路JAK2/STAT3激活,从而对OGD/R模型产生神经保护作用。3)TEN可能通过直接激活SOCS3,负反馈抑制JAK2/STAT3信号通路,从而对OGD/R模型产生神经保护作用。4)HSYA、TEN可能通过协同激活SOCS3,产生负反馈作用共同抑制JAK2/STAT3通路激活,减缓炎症反应,改善神经元活性。综上所述,HSYA、TEN通过协同作用改善脑缺血损伤,发挥神经保护作用。研究结果初步阐明了临床上常用两味中药的单体提取物HSYA、TEN在CIRI中发挥作用的分子机制,补充了红花类、远志类中草药治疗缺血性脑卒中的理论依据。首次将HSYA配伍TEN用于治疗缺血性脑卒中,充实了“痰瘀同治”理论,其改善脑缺血损伤的潜在分子机制为治疗该病提供新药靶,对临床具有重要指导价值。

关键词：脑缺血损伤大脑中动脉栓塞模型糖氧剥夺/复氧模型羟基红花黄色素A 远志皂苷元痰瘀同治配伍药效学 JAK2/STAT3/SOCS3通路