编码大鼠RGMa的shRNA真核表达载体构建及其干扰效率的筛选鉴定

作     者：殷成 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：秦新月

授予年度：2009年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：糖氧剥夺/复氧模型 海马神经元 体外培养 轴突 RNAi 质粒 转染 PC12 

摘      要：目的:中枢神经系统神经元缺血缺氧损伤后再生极其困难,但近年研究表明,神经元轴突在遭受缺血缺氧或机械损害后却可以在干预因素下再生[1,2],同时再生的轴突促使原受损轴突支配区域的功能恢复。鉴于离体细胞模型能更好的反映神经元轴突的形态变化并便于研究者描述[3],因此为了更好的观察神经元轴突的受损和干预后的再生状态,建立准确有效的轴突模型显得必要。本研究利用无血清培养基体外培养[4]SD乳鼠海马神经元为基础,建立轴突糖氧剥夺/复氧模型,为神经元糖氧剥夺/复氧后损伤及轴突再生的研究提供实验依据。 方法:1.海马神经元培养无菌条件下取出生后24 h内的乳鼠大脑海马,使用巴氏管和340目筛网吹打及过滤,制备细胞悬液,接种于细胞培养板中[5]。在37℃、5%的二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)中培养,2.神经元鉴定及纯度检测海马神经元培养6 d后,NSE单克隆抗体免疫组化染色鉴定神经元。阴性对照用0.01 mol/L PBS代替一抗。镜下观察,阳性细胞胞浆内有棕黄色颗粒沉着。3.原代神经元糖氧剥夺/复氧损伤模型制备[6]神经元以24孔培养板培养,实验分为正常对照组、糖氧剥夺/复氧组。正常对照组在常规条件下继续培养;糖氧剥夺/复氧组分别为糖氧剥夺0.5、1.0、1.5 h后再复氧。制备模型前以平衡盐缓冲液冲洗数次,使葡萄糖终浓度小于1 mmol/ml。每孔加入100 ml无糖D-Hanks液,放人缺氧盒内,持续缓慢通人含有95% N2、5% CO2的混合气体分别0.5、1.0、1.5 h,取出并吸弃平衡盐缓冲液,换以完全培养基孵育,置人CO2培养箱孵育。4.乳酸脱氢酶(LDH)的测定于不同时间点收集各组神经元的培养液,使用LDH试剂盒进行乳酸脱氢酶检测,使用550型全自动酶标仪(美国BioRad公司)。在波长440 nm处检测各管吸光度。 结果:1.神经元生长及鉴定使用倒置相差显微镜观察,接种初期海马神经元呈圆形, 3～4 d细胞有明显增长的突起并相互连接形成稀疏的网络, 6 d神经元细胞体进一步增大,突起增粗增长,连接成网,细胞体突起光晕明显,立体感及折光性强。第6天的细胞,NSE免疫组化染色(DAB),细胞被染成棕褐色为阳性,不被染色的为阴性细胞。2.糖氧剥夺/复氧对海马神经元存活率以及LDH的影响,与正常对照组细胞比较,糖氧剥夺/复氧3组细胞培养液中LDH活力均升高且有统计学意义(P0.05);在糖氧剥夺/复氧3组细胞之间,糖氧剥夺0.5 h后复氧,糖氧剥夺1.0 h后复氧和糖氧剥夺1.5 h后复氧,培养液LDH亦值有统计学意义(P0.05)。3.糖氧剥夺/复氧对海马神经元轴突长度的影响在不同时间点观察3组糖氧剥夺/复氧神经元的生存状况,发现糖氧剥夺0.5 h复氧后,神经元存活率较高,同时轴突有变短尚未完全消失。其中轴突长度随复氧时间延长而缩短,使用Image-Pro Plus 6.0统计轴突长度,其中正常神经元,糖氧剥夺0.5h,糖氧剥夺0.5h/复氧1h,糖氧剥夺0.5h/复氧5h,糖氧剥夺0.5h/复氧24h轴突长度分别76.27±19.63,70.34±12.30,65.97±16.91,61.48±9.37,57.73±16.74(um),且各组之间轴突长度比较有统计学意义(P0.05)。 结论:在糖氧剥夺/复氧模型的建立过程中,发现糖氧剥夺0.5 h再复氧后,神经元存活率较高,同时轴突有变短尚未完全消失,由此显示成功了建立神经元的轴突糖氧剥夺模型。 目的RGMa为一种膜蛋白,能特异性的与其受体Neogenin结合,激活下游的Rho kinas途径使神经元生长锥崩解,从而抑制了受损轴突的再生。目前已报道使用RGMa蛋白抗体干预RGMa功能从而达到促进受损后轴突再生的目的,而RNA干扰技术能在在基因水平上降解编码RGMa蛋白的mRNA,降低其蛋白的翻译从而达到阻断RGMa-Neogenin途径。本研究中,在离体细胞模型上面,使用RNA干扰技术,检测RNAi对RGMa蛋白表达的影响,并筛选出最佳沉默效率的RNAi片段,为后继的在体动物实验打下基础。 方法1.表达RGMa-shRNA质粒设计、构建和酶切鉴定根据GenBank中RGMa的核苷酸序列(No. NM01107524)和shRNA设计原则,运用RNA设计软件设计3对shRNA将化学合成的正义链和反义链加热到94摄氏度退火获得上游形成BamHI位点、下游形成HindlII位点的双链DNA片段形成双链的siRNA表达模板。以BamHl、HindlII双酶切质粒载体pgensil线性化,琼脂糖凝胶回收试剂盒回收酶切片段。将退火获得的双链DNA片段和酶切载体在T4 DNA连接酶作用下,4摄氏度过夜连接。取5ul连接产物热休克法转化入感受态大肠杆菌DH 5a,均匀涂抹在含3