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应用于大肠杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌中的穿梭载体的构建

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应用于大肠杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌中的穿梭载体的构建

作者：张琳华东理工大学

学位级别：硕士

氧化葡萄糖酸杆菌能够氧化大量的碳水化合物和酒精。反应产生的乙醛、酮和有机酸可以在培养基中积累。由于大量反应是由反应中心位于外周胞质空间的膜结合脱氢酶催化的,所以反应底物不需要转运入细胞内。鉴于上述特征,氧化葡萄糖酸杆菌... 详细信息

氧化葡萄糖酸杆菌能够氧化大量的碳水化合物和酒精。反应产生的乙醛、酮和有机酸可以在培养基中积累。由于大量反应是由反应中心位于外周胞质空间的膜结合脱氢酶催化的,所以反应底物不需要转运入细胞内。鉴于上述特征,氧化葡萄糖酸杆菌被广泛应用于工业生产中,用于例如二羟基丙酮和维生素C等的生产。随着对能够应用于工业生产中的重要的氧化葡萄糖酸杆菌菌株的研究兴趣的日益增加,基因工程手段被逐渐用于进行菌株的改良。将含有编码脱氢酶基因的多拷贝质粒转入Gluconobacter oxydans菌株时,能显著增加一些重要的工业产物如5-酮-D-葡萄糖酸和酯的产量。本课题从Gluconobacter oxydans DSM2003的内源性质粒入手,构建了既可以在大肠杆菌中复制又可以在氧化葡萄糖酸杆菌中复制的穿梭载体,并将其命名为pZL1。此穿梭载体在进行约144h的传代后,仍保持有较高的稳定性。采用实时定量荧光PCR的方法,准确地测量了穿梭载体在氧化葡萄糖酸杆菌中的相对拷贝数。为了检测此穿梭载体表达外源基因的效果,进一步以pZL1为基础构建了含有受氧化葡萄糖酸杆菌中的强启动子tufB调控的报告基因的表达载体。通过酶标仪检测与荧光显微镜观察,验证了报告基因在氧化葡萄糖酸杆菌中的成功表达。且利用pZL1表达报告基因的效果与利用pBBR1MCS5表达报告基因的效果相当。

关键词：氧化葡萄糖酸杆菌穿梭载体同源基因外源基因表达

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穿梭载体与哺乳动物细胞诱变研究

癌变．畸变．突变 1992年第2期4卷 40-46页

作者：林凡华西医科大学卫生毒理学研究室医学分子生物学研究室

1.前言哺乳动物细胞的诱变研究在近几十年中有了飞速的发展。但直接研究哺乳动物细胞还有在一定的困难,不象在原核细胞中那样容易得到许多资料。目前大多数是进行特定位点的诱变研究,即用一定的选择性培养基选择具有特定位点突变,并表... 详细信息

1.前言哺乳动物细胞的诱变研究在近几十年中有了飞速的发展。但直接研究哺乳动物细胞还有在一定的困难,不象在原核细胞中那样容易得到许多资料。目前大多数是进行特定位点的诱变研究,即用一定的选择性培养基选择具有特定位点突变,并表现出一特定表型的细胞株作为研究系统。但要分离到某种可供选择的突变株是很困难的,耗时较多,而且得到的信息也很有限。

关键词：穿梭载体哺乳动物细胞诱变

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大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体的构建及应用

畜牧与兽医 2006年第9期38卷 8-11页

作者：白晓婷张爱玲曹要玲杨明明龚月生西北农林科技大学动物科技学院

以大肠杆菌pMB1复制类型质粒pUC18为模板,PCR扩增了700bp的含质粒复制起始点和复制蛋白序列的DNA片段,克隆到质粒pBluskm的多克隆位点,得到含大肠杆菌质粒复制基因的中间载体pE3;以革兰氏阳性菌质粒pGDV1为模板,PCR扩增了含革兰氏阳性... 详细信息

以大肠杆菌pMB1复制类型质粒pUC18为模板,PCR扩增了700bp的含质粒复制起始点和复制蛋白序列的DNA片段,克隆到质粒pBluskm的多克隆位点,得到含大肠杆菌质粒复制基因的中间载体pE3;以革兰氏阳性菌质粒pGDV1为模板,PCR扩增了含革兰氏阳性菌质粒正负链复制区域的2·5kb片段,并与pE3载体上的大肠杆菌复制子和复制蛋白连接构建了3·2kb的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pGJ103。电转化pGJ103质粒至枯草杆菌DB104和1A747,均能稳定地复制。以pGJ103为骨架,克隆了不同大小的生物素基因片段,均能正确稳定地复制,证明载体有良好的承载能力。将2kb的热稳定性β-半乳糖苷酶基因(bga)克隆至pGJ103构建了载体启动子检测载体pGJ199。用pGJ199质粒载体作为启动子检测载体,对革兰氏阳性菌启动子片段P59进行了转录活性检测。并以该载体为启动子探测工具,通过鸟枪法得到了大量启动子片段。

关键词：穿梭载体枯草杆菌启动子

实验性家兔骨关节炎的基因治疗Ⅰ:带有治疗基因的穿梭载体pLXSNhIL-1ra的构建及真核表达

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中国运动医学杂志 2003年第5期22卷 458-462页

作者：张继英余家阔于长隆曲绵域北京大学第三医院运动医学研究所 100083

本研究用含有人白细胞介素 - 1受体拮抗蛋白基因 (hIL - 1ra)的质粒pCD1-hIL - 1a和反转录病毒穿梭质粒pLXSN ,通过基因重组的方法 ,重组完成带有治疗基因hIL - 1ra的反转录病毒穿梭质粒pLXSNhIL - 1ra。通过DNA限制性内切酶的酶切鉴定 ... 详细信息

本研究用含有人白细胞介素 - 1受体拮抗蛋白基因 (hIL - 1ra)的质粒pCD1-hIL - 1a和反转录病毒穿梭质粒pLXSN ,通过基因重组的方法 ,重组完成带有治疗基因hIL - 1ra的反转录病毒穿梭质粒pLXSNhIL - 1ra。通过DNA限制性内切酶的酶切鉴定 ,证明插入方向正确 ,通过把pLXSNhIL - 1ra穿梭质粒转染到Cos - 7细胞中进行真核表达 ,证明该质粒能够成功表达hIL - 1ra基因产物 ,为下一步用hIL - 1ra对骨关节炎动物模型进行基因治疗工作奠定了基础。

关键词：实验性家兔骨关节炎基因治疗穿梭载体 pLXSNhIL-1ra 真核表达

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人生长激素的酵母/哺乳动物穿梭载体的构建

广东医学 2005年第11期26卷 1473-1475页

作者：汪宗桂郑文岭马文丽梁念慈广东医学院生化教研室广东湛江524023 华南基因组研究中心广州510800 南方医科大学基因工程研究所广州510515

目的酿酒酵母已被证实可作为载体应用于口服基因治疗及免疫中。为研究人生长激素(HGH)以酿酒酵母作为运送载体的口服基因药物,需要构建一种能够在酵母中复制而在哺乳动物细胞表达的HGH穿梭载体。方法利用ECHO克隆系统先构建出HGH的哺乳... 详细信息

目的酿酒酵母已被证实可作为载体应用于口服基因治疗及免疫中。为研究人生长激素(HGH)以酿酒酵母作为运送载体的口服基因药物,需要构建一种能够在酵母中复制而在哺乳动物细胞表达的HGH穿梭载体。方法利用ECHO克隆系统先构建出HGH的哺乳动物表达载体,使HGH处于CMV启动子的调控下;然后设计引物扩增CMV-HGH片段,连接到酿酒酵母表达载体pESC-URA中,构建HGH的酵母/哺乳动物穿梭载体。结果经EcoRI单酶切、EcoRI/SpeI双酶切、菌落PCR以及序列测定鉴定,确认所构建的确为酵母/哺乳动物穿梭载体pESC-CMV-HGH。结论成功构建的穿梭载体可在酿酒酵母中复制,在哺乳动物中受CMV启动子的调控进行表达,为HGH的口服基因药物研制打下了基础。

关键词：酿酒酵母穿梭载体哺乳动物人生长激素口服基因治疗动物细胞表达酵母表达载体 HGH 基因药物 ECHO 引物扩增序列测定药物研制启动子 CMV PCR 复制调控酶切

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丙酸菌—大肠杆菌穿梭载体构建及表达

丙酸菌—大肠杆菌穿梭载体构建及表达

作者：薛茹河北科技大学

学位级别：硕士

丙酸菌是一类厌氧异养革兰氏阳性菌，在其生长期间可产生丙酸故命名为丙酸菌。从来源分类为皮肤类与乳品类，乳品类丙酸菌，最初用于乳制品如奶酪的发香作用，具有广泛的益生菌活性，后又发现这类丙酸菌还能够在细胞内积累维生素B12，... 详细信息

丙酸菌是一类厌氧异养革兰氏阳性菌，在其生长期间可产生丙酸故命名为丙酸菌。从来源分类为皮肤类与乳品类，乳品类丙酸菌，最初用于乳制品如奶酪的发香作用，具有广泛的益生菌活性，后又发现这类丙酸菌还能够在细胞内积累维生素B12，因此也是目前工业化生产维生素B12的主要菌株，此外这类丙酸菌还应用于发酵丙酸、杆菌素和四吡咯化合物。国外已经开展了对丙酸菌的分子生物学研究，国内研究未见报道，为了提高谢氏丙酸菌（***）的维生素B12产量，本研究以谢氏丙酸菌WT为宿主研究材料，首次建立了分子操作的基本实验技术，主要结论如下： 1、构建了丙酸菌（***）-大肠杆菌（***）之间的穿梭表达载体pTD-PcsAF。本实验将大肠杆菌克隆载体T-PcsAF的PcsAF启动子序列，通过酶切连接的方式插入到启动子捕获载体pTD210上，构建了谢氏丙酸菌（***）-大肠杆菌（E. coli）穿梭表达载体pTD-PcsAF。此载体能够在丙酸菌WT和大肠杆菌DH5α中进行复制表达。 2、建立并优化了了适宜丙酸菌菌株WT的转化条件，使转化效率稳定且有提高。以重组载体pTD-PcsAF为质粒DNA进行转化条件研究，最佳转化条件为：在丙酸菌WT生长对数中期，即OD600达到1.0时制备感受态细胞;利用10%甘油作为洗涤缓冲液洗涤细胞;电转条件为场强度为1.0kV/cm,电阻为250，电容为25μF;质粒DNA浓度为1μg/μL;电击后丙酸菌复原时间为20h时，具有较好的转化效率。 3、将来自类球红假单胞菌（Rhodobacter sphaeroides）的ALA合成酶基因插入到所构建的穿梭载体pTD-PcsAF上，构建了表达载体pTD-HemA，并转化至丙酸菌中WT中，对获得的突变株提取RNA，进行RT-PCR，证实HemA基因在菌株pTD-HemA中已进行了表达。但突变株ALA含量较野生型未有显著提高。

关键词：丙酸菌穿梭载体 ALA合成酶转化反转录

HaNPV穿梭载体的构建及绿色荧光蛋白基因在棉铃虫中的表达

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武汉大学学报（自然科学版） 1997年第6期43卷 819-820页

作者：朱应齐义鹏刘德立武汉大学病毒研究所

ＨａＮＰＶ穿梭载体的构建及绿色荧光蛋白基因在棉铃虫中的表达＊朱应齐义鹏＊＊刘德立（武汉大学病毒研究所，武汉４３００７２）关键词棉铃虫核型多角体病毒，穿梭载体，绿色荧光蛋白基因分类号Ｑ７８，Ｓ８５２．６５杆状病毒表达载... 详细信息

ＨａＮＰＶ穿梭载体的构建及绿色荧光蛋白基因在棉铃虫中的表达＊朱应齐义鹏＊＊刘德立（武汉大学病毒研究所，武汉４３００７２）关键词棉铃虫核型多角体病毒，穿梭载体，绿色荧光蛋白基因分类号Ｑ７８，Ｓ８５２．６５杆状病毒表达载体被广泛用于表达各种外源基因．由于...

关键词：棉铃虫多角体病毒穿梭载体 gfp基因 HaNPV

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鸭瘟重组病毒穿梭载体的构建及分析

实验动物科学 2017年第3期34卷 16-19,23页

作者：刘柏含牛银杰赵丽丽弥春霞陈洪岩牡丹江师范学院生命科学与技术学院牡丹江157011 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069

目的本研究目的为构建重组穿梭载体,拯救带有增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)重组病毒,为重组二联苗的研制奠定基础。方法选择已经证实的US区域的US2-SORF3、US7-US8和UL区域中的UL15-UL18的非编码区作为... 详细信息

目的本研究目的为构建重组穿梭载体,拯救带有增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)重组病毒,为重组二联苗的研制奠定基础。方法选择已经证实的US区域的US2-SORF3、US7-US8和UL区域中的UL15-UL18的非编码区作为插入位点构建穿梭载体P-US2-SORF3-EGFP,P-UL15-UL18-EGFP,P-US7-US8-EGFP。在已感染疫苗毒的鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblasts,CEFs)中转染穿梭载体,经细胞同源重组,收集细胞上清,进行噬斑筛选及纯化。结果成功构建了三个带有EGFP标签的穿梭载体,p Blusecript II SK构建的穿梭载体未成功筛选到重组噬斑而用p UC18构建的穿梭载体成功筛选到重组噬斑。结论拯救鸭瘟重组毒的研究中,p Blusecript II SK载体可能不是最佳的适用载体,也可能是插入位点为病毒复制的必须区。

关键词：鸭瘟病毒穿梭载体噬斑纯化

大肠杆菌-酿酒酵母启动子探针穿梭载体的构建

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