应用于大肠杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌中的穿梭载体的构建

作     者：张琳 

作者单位：华东理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马昱澍

授予年度：2010年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：氧化葡萄糖酸杆菌 穿梭载体 同源基因 外源基因 表达 

摘      要：氧化葡萄糖酸杆菌能够氧化大量的碳水化合物和酒精。反应产生的乙醛、酮和有机酸可以在培养基中积累。由于大量反应是由反应中心位于外周胞质空间的膜结合脱氢酶催化的,所以反应底物不需要转运入细胞内。鉴于上述特征,氧化葡萄糖酸杆菌被广泛应用于工业生产中,用于例如二羟基丙酮和维生素C等的生产。随着对能够应用于工业生产中的重要的氧化葡萄糖酸杆菌菌株的研究兴趣的日益增加,基因工程手段被逐渐用于进行菌株的改良。将含有编码脱氢酶基因的多拷贝质粒转入Gluconobacter oxydans菌株时,能显著增加一些重要的工业产物如5-酮-D-葡萄糖酸和酯的产量。 本课题从Gluconobacter oxydans DSM2003的内源性质粒入手,构建了既可以在大肠杆菌中复制又可以在氧化葡萄糖酸杆菌中复制的穿梭载体,并将其命名为pZL1。此穿梭载体在进行约144h的传代后,仍保持有较高的稳定性。采用实时定量荧光PCR的方法,准确地测量了穿梭载体在氧化葡萄糖酸杆菌中的相对拷贝数。为了检测此穿梭载体表达外源基因的效果,进一步以pZL1为基础构建了含有受氧化葡萄糖酸杆菌中的强启动子tufB调控的报告基因的表达载体。通过酶标仪检测与荧光显微镜观察,验证了报告基因在氧化葡萄糖酸杆菌中的成功表达。且利用pZL1表达报告基因的效果与利用pBBR1MCS5表达报告基因的效果相当。