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嗜酸乳杆菌质粒的分析和穿梭载体的构建

食品工业科技 2023年第13期44卷 127-133页

作者：顾斌涛郭建军曾静聂俊辉王通熊大维魏国汶袁林江西省科学院微生物研究所江西南昌330096

为分析嗜酸乳杆菌内源性质粒pDX,并基于该质粒构建大肠杆菌-嗜酸乳杆菌穿梭载体。本研究从嗜酸乳杆菌XW118中分离获得内源性的质粒pDX,对其进行序列测定及功能分析,然后利用质粒pDX的复制子构建了能在大肠杆菌和乳酸菌中穿梭的载体,并... 详细信息

为分析嗜酸乳杆菌内源性质粒pDX,并基于该质粒构建大肠杆菌-嗜酸乳杆菌穿梭载体。本研究从嗜酸乳杆菌XW118中分离获得内源性的质粒pDX,对其进行序列测定及功能分析,然后利用质粒pDX的复制子构建了能在大肠杆菌和乳酸菌中穿梭的载体,并研究嗜酸乳杆菌的内源性质粒启动子在大肠杆菌中的活性和穿梭载体在乳酸菌中宿主的范围、转化效率和传代稳定性。结果显示嗜酸乳杆菌质粒pDX大小为2062 bp,GC含量为38.2%,包含4个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),推定为滚环复制质粒。质粒pDX在嗜酸乳杆菌中的拷贝数最高为31.05。本研究构建了基于质粒pDX复制子和启动子的大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体。该载体可转化多种类型的乳酸菌,转化效率在0.24×10^(2)~2.75×10^(3)CFU/μg(质粒量)之间,质粒丢失率在25.45%~48.36%之间。本研究通过构建获得能在大肠杆菌-乳酸菌穿梭的载体,并获得了在大肠杆菌中具有活性的乳酸菌内源性质粒的启动子,为乳酸菌基因工程和大肠杆菌代谢工程提供了新的操作途径。

关键词：穿梭载体嗜酸乳杆菌质粒乳酸菌转化效率

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穿梭载体转基因鼠诱变研究进展

中华医学遗传学杂志 1995年第3期12卷 163-166页

作者：王浩傅继梁华西医科大学医学分子生物学研究室第二军医大学生物学教研室

穿梭载体转基因鼠诱变研究进展王浩，傅继梁进行哺乳动物细胞ＤＮＡ损伤、修复和突变机理研究的目的在于了解和揭示突变的生物学效应，全面认识突变与人类遗传病（生殖细胞突变）、突变与肿瘤（体细胞突变）的发生发展关系，以及生物进... 详细信息

穿梭载体转基因鼠诱变研究进展王浩，傅继梁进行哺乳动物细胞ＤＮＡ损伤、修复和突变机理研究的目的在于了解和揭示突变的生物学效应，全面认识突变与人类遗传病（生殖细胞突变）、突变与肿瘤（体细胞突变）的发生发展关系，以及生物进化等诸多生物科学的重大问题。８０年...

关键词：转基因动物鼠穿梭载体诱变

单重靶向条件复制型腺病毒穿梭载体pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K的构建及鉴定

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吉林大学学报（医学版） 2010年第5期36卷 821-824页

作者：王宏芳李金华刘扬李艳博王志成刘威武龚守良吉林大学公共卫生学院卫生部放射生物学重点实验室吉林长春130021

目的:构建并鉴定一种新型E1A基因CR2区选择性缺失的腺病毒穿梭载体pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K,为包装单重靶向条件复制型腺病毒进行肿瘤基因治疗奠定基础。方法:采用RT-PCR法从人胚肾细胞(293T)中扩增条件复制型腺病毒必需的E1区基因,包... 详细信息

目的:构建并鉴定一种新型E1A基因CR2区选择性缺失的腺病毒穿梭载体pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K,为包装单重靶向条件复制型腺病毒进行肿瘤基因治疗奠定基础。方法:采用RT-PCR法从人胚肾细胞(293T)中扩增条件复制型腺病毒必需的E1区基因,包括E1A、E1Bp及E1B55K基因片段;重叠PCR法扩增CR2区缺失的E1A基因;采用基因重组技术构建pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K重组质粒,并进行PCR及酶切鉴定。结果:经测序证实获得的E1B55K及CR2区缺失的E1A基因与GenBank公布的完全一致,E1A基因CR2区缺失的pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K质粒经分别经XbaⅠ与KpnⅠ单酶切,得到大小约为817和1244bp的酶切片段,PCR鉴定得到约250及1148bp的基因片段,鉴定结果与预期结果完全一致。结论:E1A基因CR2区选择性缺失的单重靶向条件复制型腺穿梭载体pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K构建成功。

关键词：条件复制型腺病毒穿梭载体 E1A基因

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***穿梭载体的构建及cry1C基因的表达

Acta Genetica Sinica 2000年第7期27卷 647-653页

作者：何翔刘坤李冬颖马明耿运琪陈启民南开大学生命科学学院天津300071

以pUC19为母体，克隆了Btken－Ag（***）的复制起始区（～1．6kb）和pUC4K的aphⅠ基因，构建成穿梭载体pHV－1。pHV－1在***中经100个世代，质粒保持率在80％以上；5在Bti4Q8（***4Q8）中经40个世代，质粒保持率在80％以上。将***热稳... 详细信息

以pUC19为母体，克隆了Btken－Ag（***）的复制起始区（～1．6kb）和pUC4K的aphⅠ基因，构建成穿梭载体pHV－1。pHV－1在***中经100个世代，质粒保持率在80％以上；5在Bti4Q8（***4Q8）中经40个世代，质粒保持率在80％以上。将***热稳定α－淀粉酶基因启动子控制下的Bt9510（***9510）的crylC结构基因插入pHV－1，构建成重组质粒pHV－crylC，电激转化导入Bit4Q8。光学显微镜下观察，Bit4Q8无晶体产生；而Bit4Q8（pHV－crylC）则出现典型的菱形晶体，其晶体略小于Bt9510。生物测定结果表明表达的Cry1C蛋白对甜菜夜蛾具有一定的毒杀活性。

关键词：穿梭载体 Bt cry1C基因生物杀虫剂遗传改良

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大肠杆菌-链霉菌穿梭载体的构建及应用

生物工程学报 1998年第1期14卷 6-12页

作者：杨闰英胡志浩邓子新李季伦华中农业大学生命科学技术学院中国农业大学生物学院

ＩＪ６０２１和ｐＩＪ４１２３是链霉菌的高拷贝表达载体，它们携带有受硫链丝菌素诱导的强启动子ＰｔｉｐＡ。分别在它们的合适位点插入大肠杆菌质粒的复制子和在大肠杆菌中选择用的抗性标记基因（ｂｌａ），得到了两个能在大肠杆菌和... 详细信息

ＩＪ６０２１和ｐＩＪ４１２３是链霉菌的高拷贝表达载体，它们携带有受硫链丝菌素诱导的强启动子ＰｔｉｐＡ。分别在它们的合适位点插入大肠杆菌质粒的复制子和在大肠杆菌中选择用的抗性标记基因（ｂｌａ），得到了两个能在大肠杆菌和链霉菌中穿梭复制、并保持结构稳定的链霉菌表达载体：ｐＨＺ１２７１和ｐＨＺ１２７２。将透明颤菌（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｉａｓｐ．）血红蛋白基因（ｖｈｂ）克隆到ｐＨＺ１２７２中，用它转化变铅青链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ），经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ分析和ＣＯ结合实验表明，在变铅青链霉菌中表达出了有生物活性的透明颤菌血红蛋白，从而证明所构建的ｐＨＺ１２７２载体具有在链霉菌中表达外源基因的功能。

关键词：链霉菌大肠杆菌穿梭载体血红蛋白基因表达

新型杆状病毒穿梭载体及绿色荧光蛋白在棉铃虫中的表达

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科学通报 1998年第20期43卷 2178-2183页

作者：朱应齐义鹏武汉大学病毒研究所武汉430072

利用棉铃虫核型多角体病毒的全基因组DNA构建转座_穿梭载体Hanpvid ,它既能在大肠杆菌中以质粒的形式复制 ,又能在棉铃虫细胞中复制形成感染性病毒粒子 .Hanpvid携带转座_穿梭盒 ,包括原核复制子miniF ,卡那霉素抗性基因Kan ,LacZα和Tn... 详细信息

利用棉铃虫核型多角体病毒的全基因组DNA构建转座_穿梭载体Hanpvid ,它既能在大肠杆菌中以质粒的形式复制 ,又能在棉铃虫细胞中复制形成感染性病毒粒子 .Hanpvid携带转座_穿梭盒 ,包括原核复制子miniF ,卡那霉素抗性基因Kan ,LacZα和Tn7转座子的接受位点attTn7.另一供体质粒以转座的方式将绿色荧光蛋白基因 ( gfp)和经亚克隆的多角体蛋白基因 (ocu)整合到Hanpvid的attTn7位点上成为重组病毒rHa_FaGP .Southernblotting证实重组病毒的构建是正确的 ,SDS_PAGE证明 gfp和ocu在棉铃虫细胞中高效表达 .以重组病毒感染 3龄幼虫 ,4d后 ,能看到大量发绿色荧光的血淋巴细胞 ,6d后 ,在自然光下即可见发绿色荧光的棉铃虫幼虫 .

关键词：棉铃虫核多角体病毒穿梭载体基因表达

利用Hsp基因调控元件构建胞内表达的***-BCG穿梭载体

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中华微生物学和免疫学杂志 2003年第8期23卷 629-632页

作者：史皆然李元戚好文李别虎范雄林第四军医大学西京医院呼吸内科西安710032 第四军医大学西京医院微生物学教研室西安710032

目的　构建能够携带外源蛋白基因并能在胞内表达的E .coli BCG (BacilleCalmette Guerin)穿梭载体。方法　用多聚酶链式反应 (PCR)从结核分枝杆菌毒株H37Rv基因中扩增出结核分枝杆菌热休克蛋白 (Hsp) 6 0N端 6个氨基酸及其上游调控元件... 详细信息

目的　构建能够携带外源蛋白基因并能在胞内表达的E .coli BCG (BacilleCalmette Guerin)穿梭载体。方法　用多聚酶链式反应 (PCR)从结核分枝杆菌毒株H37Rv基因中扩增出结核分枝杆菌热休克蛋白 (Hsp) 6 0N端 6个氨基酸及其上游调控元件基因 ,克隆入E .coli BCG穿梭载体pOLYG中 ,以屋尘螨抗原 (Derp2 )为外源蛋白 ,用间接免疫荧光染色法观察该载体介导的Derp2基因在牡牛分枝杆菌 (M .vaccae)宿主中的表达。结果　经测序证实所克隆的Hsp6 0ss基因序列正确 ,所构建的胞浆内表达E .coli BCG穿梭载体 (pIC)能完成在大肠杆菌和M .vaccae细胞之间的穿梭 ,并介导抗生素抗性基因的表达 ,经免疫荧光检查外源基因Derp2可表达于M .vaccae宿主胞内 ,并受到培养温度的调节。结论　成功构建了在M .vaccae胞内表达外源蛋白的E .coli BCG穿梭载体。

关键词：穿梭载体 E-coli-BCG 多聚酶链式反应结核分枝杆菌卡介苗

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粪肠球菌内源性质粒的序列分析及其穿梭载体的构建

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食品工业科技 2021年第23期42卷 141-149页

作者：袁林曾静郭建军魏国汶江西省科学院微生物研究所江西南昌330096

为了对粪肠球菌EXW27的内源性质粒pXW进行DNA序列的测定和分析,并基于其最小复制子构建大肠杆菌-粪肠球菌穿梭载体。本研究从具有优良益生特性的粪肠球菌EXW27中分离得到了内源性质粒pXW,对其进行了DNA序列的测定及分析,然后利用质粒pX... 详细信息

为了对粪肠球菌EXW27的内源性质粒pXW进行DNA序列的测定和分析,并基于其最小复制子构建大肠杆菌-粪肠球菌穿梭载体。本研究从具有优良益生特性的粪肠球菌EXW27中分离得到了内源性质粒pXW,对其进行了DNA序列的测定及分析,然后利用质粒pXW的复制子构建大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体,并研究大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体的宿主范围、转化效率和稳定性。结果表明该质粒大小为8617 bp,GC含量为33.29%,包含8个ORF,推定为θ型复制质粒。质粒pXW在粪肠球菌EXW27中拷贝数最高可达32.09±0.93,表明质粒pXW属于高拷贝数质粒。本研究确定了质粒pXW的最小复制子,并基于该复制子构建了大肠杆菌-粪肠球菌穿梭载体pXWM1。该穿梭载体具有较宽的宿主范围,可成功转化至不同类型乳酸菌,转化效率介于1.96×10^(2)~8.96×10^(4) CFU/μg (质粒DNA)之间,质粒丢失率介于28.54%~54.17%之间。本研究成功构建了一个具有宽宿主范围、高转化效率以及高稳定性的大肠杆菌-粪肠球菌穿梭载体,为乳酸菌基因操作提供了新工具。

关键词：粪肠球菌内源性质粒 θ型复制穿梭载体大肠杆菌

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枯草杆菌-大肠杆菌多功能穿梭载体的构建

生物工程学报 1991年第3期7卷 224-229页

作者：郭兴华熊占周民贾士芳许怡中国科学院微生物研究所江西省科学院微生物研究所北京大学生物系

由枯草杆菌载体pUB110和大肠杆菌载体pGEM3构建了两个新的多功能穿梭载体pBE2和pBE3,它们具有强启动子和多酶切位点区。这两个载体能在枯草杆菌和大肠杆菌中复制和表达,是比较理想的载体。

关键词：穿梭载体枯草杆菌大肠杆菌