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结核分枝杆菌lhp-esat6融合基因穿梭表达载体的构建及在BCG中的表达

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中国人兽共患病杂志 2004年第2期20卷 105-108页

作者：陈全朱道银骆旭东蒋英江山重庆医科大学微生物学教研室重庆400016

目的　构建能表达结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP10 -ESAT6融合蛋白的重组卡介苗 (recombinantBCG ,rBCG)。方法　以 pQE30 -CFP10 -ESAT6质粒为模板 ,通过PCR扩增 6 33bplhp -esat6基因 ,将该基因定向克隆到穿梭表达载体pJCH0 2中构建重... 详细信息

目的　构建能表达结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP10 -ESAT6融合蛋白的重组卡介苗 (recombinantBCG ,rBCG)。方法　以 pQE30 -CFP10 -ESAT6质粒为模板 ,通过PCR扩增 6 33bplhp -esat6基因 ,将该基因定向克隆到穿梭表达载体pJCH0 2中构建重组 pJCH0 2 -CFP10 -ESAT6质粒。用电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rBCG ,将rBCG培养 2 3天 ,于收菌前 3天每天 4 5℃热诱导 4 5min ,对表达产物作SDS -PAGE及免疫印迹分析。结果　重组质粒 pJCH0 2 -CFP10 -ESAT6经酶切及测序证实构建成功 ,并在BCG中经热诱导成功表达出了具有CFP10及ESAT6抗原性的CFP10 -ESAT6融合蛋白。结论　成功构建能表达CFP10 -ESAT6融合蛋白的重组BCG ,为发展新型结核病疫苗奠定了基础。

关键词：结核分枝杆菌 lhp—esat6融合基因穿梭表达载体构建 BCG 表达

Kringle5的真核植物细胞穿梭表达载体的构建

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郑州大学学报（医学版） 2002年第2期37卷 156-159页

作者：郑合明薛乐勋郑州大学医学实验中心细胞生物学研究室

目的 :构建含有目的基因kringle5的真核植物细胞穿梭表达载体。方法 :应用RT PCR方法 ,从正常人肝脏组织中获得kringle 5基因 ,测序后 ,再通过DNA重组技术 ,将kringle 5基因片段克隆到真核植物细胞表达载体pBI12 1和pCAMBIA330 1上。结... 详细信息

目的 :构建含有目的基因kringle5的真核植物细胞穿梭表达载体。方法 :应用RT PCR方法 ,从正常人肝脏组织中获得kringle 5基因 ,测序后 ,再通过DNA重组技术 ,将kringle 5基因片段克隆到真核植物细胞表达载体pBI12 1和pCAMBIA330 1上。结果 :得到的kringle 5基因序列测定结果与文献相符 ,重组载体pB1k5和pC33k5经酶切鉴定正确 ,含有植物高效表达CaMV35S启动子。结论 :重组载体pB1k5和pC33k5不仅可以在大肠杆菌中稳定复制。

关键词：血管抑素 kringle5基因穿梭表达载体反转录PCR 启动子CaMV35S 真核植物细胞

绿色荧光蛋白标记穿梭表达载体构建及重组乳酸菌制备

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吉林农业大学学报 2009年第3期31卷 325-329页

作者：陈晓雷杨桂连王春凤吉林农业大学动物科技学院长春130118

以红霉素耐药性基因/thyA基因双筛选压力大肠杆菌—乳酸杆菌穿梭表达载体pW425et为基本骨架,将绿色荧光蛋白(GFP)基因插入该载体,构建GFP标记的穿梭表达载体pW425et-GFP。通过连续的荧光强度检测,验证gfp基因能否在重组菌中得到稳定表... 详细信息

以红霉素耐药性基因/thyA基因双筛选压力大肠杆菌—乳酸杆菌穿梭表达载体pW425et为基本骨架,将绿色荧光蛋白(GFP)基因插入该载体,构建GFP标记的穿梭表达载体pW425et-GFP。通过连续的荧光强度检测,验证gfp基因能否在重组菌中得到稳定表达。重组表达质粒pW425et-GFP酶切和PCR鉴定结果与预期片段大小相符,SDS-PAGE显示27 kD的绿色荧光蛋白获得表达,在蓝光的激发下,可见明显的绿色荧光,且荧光稳定性强,连续传代30次仍可见荧光。结果表明已成功构建了GFP标记穿梭表达载体pW425et-GFP,为乳酸菌作为益生生理菌载体进行体内定植规律研究和食品级、疫苗级乳酸菌产品的开发奠定了基础。

关键词：绿色荧光蛋白穿梭表达载体大肠杆菌乳酸菌

抗菌肽MagaininⅡ基因穿梭表达载体的构建

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吉林农业大学学报 2008年第1期30卷 111-113页

作者：陈晓平詹冬玲贾惠文商雪娇钱爱东吉林农业大学食品科学与工程学院长春130118 吉林农业大学动物科技学院长春130118

采用SOE法人工设计并合成抗菌肽MagaininⅡ基因。按正确的阅读框架定向克隆至高效穿梭表达载体pPICZαA上,经PCR鉴定及序列分析,所转化的大肠杆菌JM109菌落中含有插入MagaininⅡ基因的重组质粒pPICZαA-Mag,结果表明成功构建了抗菌肽Mag... 详细信息

采用SOE法人工设计并合成抗菌肽MagaininⅡ基因。按正确的阅读框架定向克隆至高效穿梭表达载体pPICZαA上,经PCR鉴定及序列分析,所转化的大肠杆菌JM109菌落中含有插入MagaininⅡ基因的重组质粒pPICZαA-Mag,结果表明成功构建了抗菌肽MagaininⅡ基因穿梭表达载体pPICZαA-Mag。

关键词：抗菌肽MagaininⅡ SOE法穿梭表达载体

枯草芽孢杆菌穿梭表达载体和表面展示载体的构建

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枯草芽孢杆菌穿梭表达载体和表面展示载体的构建

作者：李志辉河北农业大学

学位级别：硕士

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种极具潜力的外源蛋白表达宿主菌，不论是用来高效表达外源蛋白还是作为口服疫苗或全细胞酶的载体，都展现出其他细菌无可比拟的优势，是研究较多、应用广泛的生物安全菌。质粒是外源蛋白异源表... 详细信息

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种极具潜力的外源蛋白表达宿主菌，不论是用来高效表达外源蛋白还是作为口服疫苗或全细胞酶的载体，都展现出其他细菌无可比拟的优势，是研究较多、应用广泛的生物安全菌。质粒是外源蛋白异源表达的必须工具，目前，可用于外源蛋白在B. subtilis中表达的质粒虽然不少，但遗传操作方便、表达效率高的E. coli-B. subtilis穿梭表达载体和能直接将外源蛋白展示在芽孢表面的穿梭表达载体仍然缺乏。本实验构建了两个穿梭表达载体和一个表面展示的载体，用4种报告基因进行了验证，主要内容如下： 1.通过融合PCR将来源于B. subtilis的木糖启动子（PxylR）序列和来源于大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体pET21b的T7肽和多克隆位点区等序列融合替换了E. coli-B. subtilis穿梭载体pHT315的多克隆位点，构建了一个能由D-木糖诱导表达的E. coli-B. subtilis穿梭表达载体pTL。PCR扩增得到了绿色荧光蛋白（GFP）基因gfp，β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因gus，人淀粉样前体蛋白(APPsw)基因APPsw和粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）脂肪酶基因lipa，并分别插入pTL的多克隆位点构建了重组质粒，转化B. subtilis WB800，获得了工程菌WB800-gfp、WB800-gus、WB800-APPsw和WB800-lipa。荧光显微镜下可以观察到WB800-gfp菌体发出绿色荧光，表明GFP成功表达，用荧光分光光度法确定了检测GFP的最佳激发波长为390nm，发射波长为507nm;以gfp为报告基因，利用荧光分光光度法经初步优化得到GFP在WB800-gfp中诱导表达条件为：在37℃、200rpm条件下，以终浓度1%的D-木糖诱导8h，GFP表达水平最高;上述条件下诱导gus、APPsw、lipa基因表达，WB800-gus菌体呈现蓝色阳性反应，Western Blot试验结果表明WB800-APPsw菌体裂解液样品在85kDa处有明显的阳性蛋白杂交条带，Rashid N p-NPP比色法检测WB800-lipa菌体裂解液样品，结果显示脂肪酶活力为72.73±0.25U/mg，较未经木糖诱导的对照提高近210倍，表明三种基因都得到很好地表达;在无抗生素选择压力的条件下，质粒pTL经连续传10代后仍表现出98.5%的高稳定性。上述结果证明pTL是一个遗传操作方便、稳定性强、表达效率高的E. coli-B. subtilis穿梭表达载体，可以表达融合有T7肽的外源融合蛋白，不影响蛋白性质，同时可为后续回收纯化操作提供便利。 2.在B. subtilis的穿梭表达载体pDG148-stuI的基础上，经遗传改造构建了一个含有Pspac启动子的E. coli-B. subtilis穿梭载体pDG150，将克隆的gfp，gus，APPsw和lipa插入pDG150构建重组质粒，分别转化B. subtilis168，获得了重组工程菌B168-gfp，B168-gus，B168-APPsw和B168-lipa。荧光显微镜观察和荧光分光光度计检测结果表明GFP在B168-gfp中获得表达，以gfp为报告基因，利用荧光分光光度法证明用IPTG诱导B168-gfp中GFP表达的最优条件为：在37℃、200rpm转速下，终浓度1mM的IPTG诱导4h，可使GFP表达量最高。在此培养条件下，GUS显色法证明B168-gus中GUS表达为阳性;Western Blot实验显示B168-APPsw菌体裂解液样品在78kDa处有阳性蛋白杂交条带，表明APPsw得到表达;Rashid N p-NPP比色法证明B168-lipa脂肪酶也获得高效表达，IPTG诱导后的脂肪酶活力为20.52±0.12U/mg，较未经诱导的对照提高近50倍;质粒传代稳定性实验表明：经连续传10代后质粒稳定性高达95.5%。 3.将芽孢衣壳蛋白CotG的启动子序列和蛋白编码序列（不含终止密码子）与质粒pDG150重组构建了表面展示载体pDG150-cotg，将gfp，gus，APPsw和lipa插入pDG150-cotg构建重组质粒，分别转化B. subtilis168，得到重组工程菌G168，U168，A168和L168。37℃、200rpm条件下在DSM培养基中培养40h收获重组工程菌的芽孢。荧光显微镜观察结果证明GFP在G168芽孢上得到成功展示;U168的芽孢加入GUS显色液后呈蓝色，表明GUS已经表达;Western Blot试验表明A168的芽孢提取液在102kDa处有阳性蛋白杂交带，说明APPsw蛋白得到成功展示，为APPsw抗体制备打

关键词：枯草芽孢杆菌穿梭表达载体启动子表面展示报告基因

一个可在板栗疫病菌中自主复制的穿梭表达载体

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一个可在板栗疫病菌中自主复制的穿梭表达载体

作者：冯友军广西大学

学位级别：硕士

本实验室2003年首次构建了可在板栗疫病菌中自主复制的穿梭质粒pGXH1130。本研究通过双酶切pGXH1130，用酶切产物自连后获得的变小的质粒转化板栗疫病菌EP713原生质体，并进行Southern杂交进一步鉴定变小的质粒是否依然具有穿梭以及自... 详细信息

本实验室2003年首次构建了可在板栗疫病菌中自主复制的穿梭质粒pGXH1130。本研究通过双酶切pGXH1130，用酶切产物自连后获得的变小的质粒转化板栗疫病菌EP713原生质体，并进行Southern杂交进一步鉴定变小的质粒是否依然具有穿梭以及自主复制的功能，逐步去除了pGXH1130上与自主复制以及穿梭无关的多余片段。将最终获得的不能继续缩小的质粒上的Trpc启动子和终止子置换为板栗疫病菌gpd启动子与终止子，并在gpd启动子与终止子之间添加了多克隆位点，将大小约为15.6kbp的pGXH1130优化为约8.9kbp大小的能在板栗疫病菌中自主复制的穿梭表达载体pFC9。pFC9以潮霉素抗性作为进行板栗疫病菌遗传转化的选择标记。Southern杂交分析表明pFC9可在板栗疫病菌细胞内自主复制。携带漆酶基因LAC-1 cDNA和基因组DNA的pFC9重组质粒都可以在板栗疫病菌低毒菌株EP713中高效表达出漆酶活性，表明pFC9可以在真菌宿主板栗疫病菌中高效表达目的基因。携带有pFC9的转化株EP713／pFC9-Lac1可以通过菌丝融合方式将潮霉素抗性传播给对潮霉素敏感的板栗疫病菌菌株EP155，表明该载体具有类似低毒病毒CHV1-EP713的在板栗疫病菌细胞质内运动的能力。穿梭表达载体pFC9的成功构建为板栗疫病菌的基因功能研究提供了一个崭新的工具。

关键词：自主复制质粒板栗疫病菌穿梭表达载体菌丝融合 pFc9

基于rhaSR嵌合操纵子的穿梭表达载体及其在鱼腥藻细胞中表达的初步研究

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生物技术通报 2008年第5期24卷 130-135页

作者：贺根和肖宜安许东风喻富根井冈山大学生命科学学院吉安343009 南京大学生命科学学院南京210093

通过PCR等基因重组技术,以pKT-215(起源于RSF1010)为载体,构建了带有PR序列(含rhaSR操纵子表达调控元件、rhaR基因、报告基因gst的嵌合操纵子)和PT序列(含rhaSR操纵子表达调控元件及rhaT基因)的二种穿梭表达载体pKT-PTR、pKT-PR。其中,... 详细信息

通过PCR等基因重组技术,以pKT-215(起源于RSF1010)为载体,构建了带有PR序列(含rhaSR操纵子表达调控元件、rhaR基因、报告基因gst的嵌合操纵子)和PT序列(含rhaSR操纵子表达调控元件及rhaT基因)的二种穿梭表达载体pKT-PTR、pKT-PR。其中,在RhaR基因上游设计和插入了增强的SD序列。首先将pKT-PTR、pKT-PR分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,在不同培养基条件下,即含鼠李糖与不含鼠李糖的培养基中进行表达,紫外分光光度计测定GST蛋白(谷胱甘肽-S-转移酶)的活性。结果表明,含嵌合操纵子的穿梭表达载体能在L-鼠李糖的诱导下表达,gst基因的表达量诱导条件下比非诱导条件下高3倍左右,且表达载体上的rhaT基因并不能提高gst的表达;其次,利用三亲结合的方法将2种表达质粒转入鱼腥藻Anabaena ***7120中,抗生素筛选后得到能稳定遗传的转基因藻,并以转基因藻的质粒DNA为模板进行PCR检测。最后,转基因藻GST酶活力分析结果表明,嵌合操纵子PR在蓝藻细胞中的诱导表达效率极低,表达条件还需进一步优化。尝试将诱导型的操纵子转入蓝藻,具有潜在的应用价值。

关键词：嵌合操纵子穿梭表达载体三亲结合基因表达

人肿瘤坏死因子α基因穿梭表达载体的构建和在鱼腥藻7120中的表达

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中国科学（C辑） 1999年第2期29卷 217-224页

作者：刘凤龙张宏斌施定基商之狄林晨邵宁彭国宏张雪艳张海霞吴锦银王捷徐旭东江悦华钟泽璞赵树进吴旻曾呈奎中国科学院植物研究所北京100093 广州军区广州总医院医学实验科广州510010 中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室北京100021 中国科学院海洋研究所实验海洋生物学开放实验室青岛266071

报道了人肿瘤坏死因子α(hTNFα)基因穿梭表达载体的构建及其在丝状体蓝藻鱼腥藻 712 0中的表达和鉴定结果 .将质粒pRL rhTNF上hTNFα的cDNA连于pRL 43 9质粒上的PpsbA启动子下游 ,得到中间载体pRL TC .进一步与穿梭质粒pDC 8重组 ,得... 详细信息

报道了人肿瘤坏死因子α(hTNFα)基因穿梭表达载体的构建及其在丝状体蓝藻鱼腥藻 712 0中的表达和鉴定结果 .将质粒pRL rhTNF上hTNFα的cDNA连于pRL 43 9质粒上的PpsbA启动子下游 ,得到中间载体pRL TC .进一步与穿梭质粒pDC 8重组 ,得到可在大肠杆菌和蓝藻中均可表达的穿梭表达载体pDC TNF .pRL rhTNF ,pRL TC和pDC TNF三者在大肠杆菌中的表达量分别为 11.8% ,16 9%和 15 .0 % .通过三亲接合转移将pDC TNF引入鱼腥藻 712 0中并获稳定遗传的转基因株 .从转基因的鱼腥藻 712 0中检测到pDC TNF质粒的存在 ,且在和TNFα的cDNA探针进行的Southern杂交中呈阳性反应 .抽提转基因藻的蛋白样品进行检测 ,在Western印迹中和TNFα单克隆抗体呈阳性反应 .采用TNF对L92 9细胞的细胞毒性方法 ,证明转基因藻粗提液中 ,TNF确有细胞毒活性 .

关键词：肿瘤坏死因子鱼腥藻穿梭表达载体基因表达

ALD和TPI基因穿梭表达载体的构建和在鱼腥藻7120中的表达

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