检索结果-南通市图书馆

烟酰胺单核苷酸的生物合成与解淀粉芽孢杆菌磷酸核糖焦磷酸合成酶晶体结构的初步解析

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

烟酰胺单核苷酸的生物合成与解淀粉芽孢杆菌磷酸核糖焦磷酸合成酶...

作者：尚云虎华中科技大学

学位级别：硕士

人体内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)水平会随着年龄的增加逐渐下降,导致各种各样与年龄相关病症的产生。外源补充的NAD因分子量较大而无法被人体细胞直接吸收和利用。但已有研究发现NAD的主要前体—... 详细信息

人体内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)水平会随着年龄的增加逐渐下降,导致各种各样与年龄相关病症的产生。外源补充的NAD因分子量较大而无法被人体细胞直接吸收和利用。但已有研究发现NAD的主要前体——β-烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide,NMN)可以被人体细胞吸收,之后通过体内的补救合成途径再转化为NAD,一定程度上恢复机体的生理活动。到目前为止,摄入NMN在已有的动物及人体实验中均显示出良好的安全性。现有的NMN合成方法主要包括化学合成、全细胞生物转化和酶法催化三种,其中化学合成需要多步反应并且有副产物产生,而借助于酶的催化或者利用微生物细胞培养合成NMN相对简单、安全和环保,具有明显的优势。为模拟生物体内合成NMN的途径,利用解淀粉芽孢杆菌来源的磷酸核糖焦磷酸合成酶(Phosphate pyrophosphate synthase from Bacillus amyloliquefaciens,ba PRS)和杜氏嗜血杆菌来源的烟酰胺磷酸核糖基转移酶(Nicotinamide phosphoribosyl transferase from Haemophilus ducreyi,hd NAMPT),以三磷酸腺苷、5-磷酸核糖和烟酰胺为原料,进行NMN的生物合成,为获得最大化产量,结合基因工程、分子生物学以及结构生物学等手段进行了以下工作:(1)利用同源重组技术,成功构建pET28a-baPRS、pET28a-hdNAMPT两个单启动子重组质粒,为便于纯化,在目的蛋白的N端均带有8×His标签和酶切位点。接着对蛋白表达条件进行了优化,其中ba PRS最佳表达条件为:宿主菌BL21(DE3)、0.5 m M异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)、37℃诱导4 h,hd NAMPT最佳表达条件为宿主菌BL21(DE3)、0.5 mM IPTG、16℃诱导24 h。另外,以pETDuet-1质粒为载体,依次插入hd NAMPT和ba PRS基因序列,构建双启动子表达载体p ETDuet-hd NAMPT-ba PRS。在28℃、0.5 m M的IPTG诱导表达20h,hd NAMPT高表达,且远高于ba PRS。经过镍柱亲和层析以及凝胶过滤层析等方式的纯化后,得到高纯度的ba PRS和hd NAMPT,SDS-PAGE电泳鉴定条带单一。(2)分别用大肠杆菌全细胞生物转化和体外酶法两种方式合成NMN并对产量进行了对比。在全细胞生物转化法中,培养基中烟酰胺的最佳添加浓度为0.5%,此时在大肠杆菌胞内有NMN的积累,而相对于p ET28a-ba PRS质粒,在转入p ET28a-hd NAMPT和p ETDuet-hd NAMPT-ba PRS质粒的大肠杆菌中有更多的NMN积累,最高为39.96μM(13.36 mg/L)。在酶法中,测定了纯化出的两种蛋白的活性,并且对反应条件进行优化,在最佳的反应体系下,双酶催化反应30 min后,NMN浓度可以达到86μM(28.7 mg/L),5-磷酸核糖和烟酰胺的转化率均达到86%,超过化学合成的底物转化率和全细胞生物转化法的产量。(3)经过试剂盒初筛和条件优化,成功得到形状和大小均合适的baPRS蛋白晶体,收集了浸泡底物5-磷酸核糖前后的X射线衍射数据,经过软件处理后得到分辨率分别为2.37(?)和3.51(?)的三维晶体结构。初步的对比和分析发现在浸泡5-磷酸核糖前后,Arg102-Ile113形成的柔性环处于两种不同状态,另外,磷酸根和5-磷酸核糖的结合位点均在Ile222-Thr231形成的环附近,可以推断出高浓度的磷酸根能够和5-磷酸核糖竞争结合位点,抑制ba PRS的催化活性。总的来说,本研究基于大肠杆菌原核表达系统,成功构建pET28a-baPRS等三个重组表达载体,经过多种方式的纯化获得高活性高纯度的ba PRS和hd NAMPT。和大肠杆菌全细胞生物转化法相比,酶反应合成比大肠杆菌全细胞生物转化法产生的NMN含量更高。对于ba PRS,成功通过X射线衍射法得到其三维结构并进行了初步分析,为后续对其进行分子层面的改造、增加酶的活性和稳定性,从而提高NMN产率奠定了理论基础。

关键词：烟酰胺单核苷酸磷酸核糖焦磷酸合成酶烟酰胺磷酸核糖基转移酶 X射线衍射晶体结构解析

3,5,2',4'-四羟基查尔酮对小鼠尿酸及尿酸合成相关酶基因的影响

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

天然产物研究与开发 2016年第1期28卷 131-135页

作者：刘恺林华高丽辉刘旭李玲牛艳芬昆明医科大学生物医学工程研究中心昆明650500 衡阳市中心医院药学部临床药学室衡阳421001

用氧嗪酸钾诱导高尿酸血症动物模型,对化合物3,5,2',4'-四羟基查尔酮(P40)的降尿酸作用及尿酸合成相关酶基因进行研究。用磷钨酸法测定小鼠血清尿酸水平,用RT-PCR测定脑组织中次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、肝脏中的磷酸核糖焦... 详细信息

用氧嗪酸钾诱导高尿酸血症动物模型,对化合物3,5,2',4'-四羟基查尔酮(P40)的降尿酸作用及尿酸合成相关酶基因进行研究。用磷钨酸法测定小鼠血清尿酸水平,用RT-PCR测定脑组织中次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、肝脏中的磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPS)和磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(PRPPAT)mRNA的表达水平。结果表明:灌胃给予高尿酸血症小鼠P40 2、4、8 mg/kg和阳性对照药别嘌醇1 mg/kg,共给药5次,每天2次,均显著降低血清尿酸水平(P<0.05,0.01),具有显著的降尿酸作用;但对HGPRT、PRPS、PRPPAT的mRNA表达水平无明显影响。

关键词： 3,5,2',4'-四羟基查尔酮高尿酸血症尿酸次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶磷酸核糖焦磷酸合成酶磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶

芒果苷对高尿酸血症小鼠血尿酸及嘌呤代谢相关酶表达的影响

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国实验方剂学杂志 2019年第2期25卷 55-59页

作者：林华袁丽仙高丽辉李玲牛艳芬昆明医科大学生物医学工程研究中心昆明650500 云南省曲靖市第二人民医院云南曲靖655000

目的:研究芒果苷对氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠血尿酸的影响以及对磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPS),磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(PRPPAT)和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT) mRNA表达水平的影响。方法:雄性昆明种小鼠60只,随机分为正... 详细信息

目的:研究芒果苷对氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠血尿酸的影响以及对磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPS),磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(PRPPAT)和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT) mRNA表达水平的影响。方法:雄性昆明种小鼠60只,随机分为正常组、高尿酸血症模型组、芒果苷1. 5,3. 0,6. 0 mg·kg^-1组、别嘌醇组(1. 0 mg·kg^-1),每组10只。按10 m L·kg-1每天灌胃给药2次,连续10次,给药后1 h再灌胃给予氧嗪酸钾(500. 0 mg·kg^-1)诱导形成高尿酸血症小鼠。磷钨酸法测血清尿酸水平,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测小鼠肝脏PRPS,PRPPAT和脑组织中HGPRT mRNA的表达水平。结果:灌胃给予氧嗪酸钾后,与正常组比较,模型组小鼠血尿酸水平显著升高(P 酶PRPS,PRPPAT和HGPRT mRNA的表达无关。

关键词：芒果苷高尿酸血症磷酸核糖焦磷酸合成酶磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

PRPS1基因突变与遗传性耳聋

中华耳科学杂志 2010年第1期8卷 57-62页

作者：李建忠袁慧军韩东一中国人民解放军总医院耳鼻咽喉科北京100853 南京军区福州总医院耳鼻咽喉科福州350025

磷酸核糖焦磷酸合成酶（phosphoribosylpy-rophosphate synthetase,简称PRS,EC2.***.6.1）,又称核糖磷酸焦磷酸激酶（Ribose-phosphate pyrophos-phokinase）,是体内唯一的催化磷酸核糖焦磷酸（PRPP）合成的酶,而PRPP是体内嘌呤、

关键词：磷酸核糖焦磷酸合成酶遗传性耳聋基因突变磷酸激酶 PRS 体内

Prs-Nampt融合蛋白的改造与全细胞催化合成NMN

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

Prs-Nampt融合蛋白的改造与全细胞催化合成NMN

作者：张雄雄浙江大学

学位级别：硕士

烟酰胺单核苷酸（Nicotinamide Mononucleotide,NMN）的化学合成所需步骤多,条件要求严格,同时伴有环境污染,且部分关键步骤收率低。而全细胞生物催化合成因其低成本、低污染、较好的收率等优点成为在环境友好的条件下合成NMN的一种颇... 详细信息

烟酰胺单核苷酸（Nicotinamide Mononucleotide,NMN）的化学合成所需步骤多,条件要求严格,同时伴有环境污染,且部分关键步骤收率低。而全细胞生物催化合成因其低成本、低污染、较好的收率等优点成为在环境友好的条件下合成NMN的一种颇具竞争力的替代途径。本研究利用磷酸核糖焦磷酸合成酶（Phosphoribosyl pyrophosphate synthase,Prs）和烟酰胺磷酸核糖转移酶（Nicotinamide phosphate ribose transferase,Nampt）链接而成的 Prs-Nampt 融合蛋白以全细胞反应的方式,催化烟酰胺（Nicotinamide,NAM）和葡萄糖合成NMN,通过对Prs-Nampt融合蛋白进行定点饱和突变、优化诱导表达条件及反应条件提高合成NMN的效率。（1）Prs-Nampt融合蛋白定点饱和突变。利用分子对接技术,根据Prs和Nampt的空间结构与参与反应结合位点的氨基酸,选择融合蛋白prs基因上R101、Q102、E110、H135和nampt基因上D219、F193、R311作为突变位点。利用PCR技术构建突变体,采用荧光法测定产物NMN浓度,筛选得到一株NMN浓度提升8.3%的突变体E110D。（2）突变体E110D表达的优化。以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导,融合蛋白多数呈包涵体状态,探索以乳糖替代IPTG进行诱导。优化后突变体E110D的诱导和培养条件为:接种1%LB的活化菌液,加入氨苄青霉素至终浓度达100mg/L,在37℃、200 rpm摇床里培养至菌液OD600=0.6 Abs,加入终浓度2 g/L乳糖和2 g/L葡萄糖作为诱导剂,在25℃、200rpm摇床里继续诱导培养24h。以此诱导及培养条件为基础,在5L发酵罐中进行高密度发酵,发酵OD600达到160Abs,得到380 g突变体湿菌体。（3）突变体E110D合成NMN的优化。以NAM和葡萄糖为反应物经全细胞催化合成得到NMN,探索出反应的最佳条件为:①NAM的投料时间为突变体E110D诱导表达18h时,②NAM终浓度为1.2 g/L,③添加终浓度为12 g/L的葡萄糖,④反应pH为7.0,⑤反应温度为30℃。经过6 h反应,NMN浓度约为16.5mg/L。以此最佳反应条件为基础,在5L发酵罐中成功实现了突变体E110D的高密度发酵及全细胞反应,在反应6h时NMN浓度达到104mg/L。

关键词：烟酰胺单核苷酸磷酸核糖焦磷酸合成酶烟酰胺磷酸核糖转移酶全细胞反应融合蛋白饱和突变

磷酸核糖焦磷酸合酶基因PRS4调控水稻种子发育的初步研究

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

磷酸核糖焦磷酸合酶基因PRS4调控水稻种子发育的初步研究

作者：吕则辉南京农业大学

学位级别：硕士

水稻是我国主要的作物之一,水稻的持续高产稳产对保障国家口粮安全至关重要。水稻种子中储存有大量的淀粉,淀粉填充的速度和质量直接影响稻米产量及品质。当前,人们对淀粉的合成已有较为深入的认识,但是目前对于淀粉合成调控因子的认识... 详细信息

水稻是我国主要的作物之一,水稻的持续高产稳产对保障国家口粮安全至关重要。水稻种子中储存有大量的淀粉,淀粉填充的速度和质量直接影响稻米产量及品质。当前,人们对淀粉的合成已有较为深入的认识,但是目前对于淀粉合成调控因子的认识仍十分有限,想要完善与淀粉相关的调控网络,需进一步发掘新的淀粉合成调控因子。利用甲基磺酸乙酯（Ethyl methane sulfonate,EMS）诱变,从粳稻品种宁粳6号的突变体库中鉴定出了一份种子发育异常突变体prs4（磷酸核糖焦磷酸合成酶4）,本研究克隆了该基因,并初步探索了其功能。主要研究结果如下:1.与野生型宁粳6号相比,prs4突变体呈现粉质不透明的籽粒表型,粒厚及千粒重降低。同时prs4突变体种子中总淀粉和直链淀粉含量均明显下降,RVA谱分析表明淀粉的峰值黏度和最终黏度均只有野生型的一半。此外,prs4突变体成熟植株的株高和分蘖数明显降低。2.半薄切片观察显示,在开花后12天（Days after flowering,DAF）的胚乳鲜样中,prs4突变体中部的胚乳细胞发育异常,复合淀粉颗粒膜碎裂,导致胚乳细胞内散乱分布着众多单粒淀粉颗粒。扫描电镜观察显示,prs4突变体淀粉颗粒同样散乱排列且存在较大空隙。3.利用prs4/N22获得的F分离群体进行基因定位,共使用743个极端个体将该基因定位于2号染色体短臂的200 kb区间内,利用全基因组测序的手段对区间内37个可能的开放阅读框（Open reading frames,ORFs）进行序列比对,发现prs4突变体在基因Os02g0714600的第2外显子上存在一处单碱基的替换,导致该位置的天冬氨酸被替换成了天冬酰胺。通过转基因互补实验证实了Os02g0714600基因为目的基因。4.进化树分析显示,PRS基因广泛存在于各个物种中。荧光定量PCR显示,该基因呈组成型表达,且在营养组织中的表达量高于发育中的胚乳。通过PRS4-GFP载体进行亚细胞定位,结果表明PRS4蛋白呈胞质定位。***4基因编码磷酸核糖焦磷酸合成酶4,负责将5-磷酸核糖催化为5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）,对该蛋白进行体外酶活测定,测定结果表明野生型和prs4突变体均具有酶活性,但prs4突变体的酶活性显著降低。6.取野生型和prs4突变体花后12天的胚乳鲜样,对淀粉相关的基因进行荧光定量PCR检测,结果显示prs4突变体中大多数淀粉相关基因表达上调;而Western blot结果显示淀粉相关基因在蛋白水平上无明显差异。7.构建PRS4过表达转基因植株,并统计转基因后代的籽粒大小,结果显示转基因后代的籽粒明显增大,且增大程度与PRS4基因的表达水平呈正相关。因此,PRS4可能具有一定的育种价值。综上所述,本研究中我们证实了磷酸核糖焦磷酸合成酶基因PRS4的单碱基突变导致该酶的活性降低,并造成了胚乳发育异常的表型。同时过表达PRS4能够使籽粒增大,具有潜在的育种价值。

关键词：水稻(Oryza sativa L.) 粉质胚乳淀粉合成磷酸核糖焦磷酸合成酶籽粒大小

PRPS1基因及其突变与相关临床综合征的研究进展

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

国际输血及血液学杂志 2020年第1期43卷 82-88页

作者：杨怡李彦欣上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心血液/肿瘤科国家卫生和计划委员会儿童血液肿瘤重点实验室 200127

PRPS1基因编码的磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRS)1是参与核酸合成的第一限速酶,其对细胞功能,特别是嘌呤、嘧啶相关的合成、代谢等有重要影响。当PRPS1基因突变引起PRS1晶体结构改变时,其编码的PRS1活性也将发生改变,进而不仅会导致嘌呤和嘧... 详细信息

PRPS1基因编码的磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRS)1是参与核酸合成的第一限速酶,其对细胞功能,特别是嘌呤、嘧啶相关的合成、代谢等有重要影响。当PRPS1基因突变引起PRS1晶体结构改变时,其编码的PRS1活性也将发生改变,进而不仅会导致嘌呤和嘧啶代谢紊乱,还会引起细胞能量代谢紊乱。此外,遗传性PRPS1基因突变会引起高耗能组织器官的功能异常,出现一系列的临床综合征。在肿瘤患者中也存在体细胞的PRPS1基因突变,可引起肿瘤耐药复发。总之,PRS1在能量代谢、细胞信号转导及核酸合成等方面发挥关键作用,对维持人体正常生理活动具有重要意义。笔者拟就PRPS1基因编码的PRS1在人体的生理功能和晶体结构、PRPS1基因及其突变对细胞代谢的调节及PRPS1基因突变相关临床综合征等方面进行综述。

关键词：磷酸核糖焦磷酸综合征代谢磷酸核糖焦磷酸合成酶 PRPS1基因

3,5,2',4'-四羟基查尔酮对大鼠尿酸及PC12细胞嘌呤代谢酶的影响

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

昆明医科大学学报 2017年第5期38卷 26-30页

作者：冯国华林华普菁莹高丽辉李玲牛艳芬昆明医科大学生物医学工程研究中心云南昆明650500 昆明医科大学第一附属医院云南昆明650032

目的研究3,5,2',4'-四羟基查尔酮(P40)对高尿酸血症大鼠尿酸的影响及对PC12细胞嘌呤代谢关键酶的影响.方法灌胃给予SD大鼠P40(2.0、4.0和8.0 mg/kg)5次,末次给药前1 h腹腔注射氧嗪酸钾(250mg/kg)诱导成高尿酸血症动物模型,注射后2 h取血... 详细信息

目的研究3,5,2',4'-四羟基查尔酮(P40)对高尿酸血症大鼠尿酸的影响及对PC12细胞嘌呤代谢关键酶的影响.方法灌胃给予SD大鼠P40(2.0、4.0和8.0 mg/kg)5次,末次给药前1 h腹腔注射氧嗪酸钾(250mg/kg)诱导成高尿酸血症动物模型,注射后2 h取血,用磷钨酸法测定血尿酸水平及肝尿酸含量.给予PC12细胞系列浓度的P40和阳性对照药别嘌醇后培养48 h,收集细胞提取总RNA,采用逆转录聚合酶链(RT-PCR)的方法,检测嘌呤代谢关键酶HGPRT、PRPS和PRPPAT m RNA的表达水平.结果给予P40 2.0、4.0 mg/kg均能显著降低高尿酸血症大鼠的血尿酸水平,和模型组相比,差异有统计学意义(P<0.01),但对肝尿酸含量没有影响.给予P40 1×10^(-8),1×10^(-7),1×10^(-6) mol/L处理PC12细胞48 h后,对HGPRT、PRPS和PRPPAT基因的m RNA表达没有明显影响,与对照组相比差异无统计学意义(P<0.01).结论在本实验条件下,P40能降低氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症大鼠的血尿酸水平,对PC12细胞的HGPRT、PRPS和PRPPAT基因的m RNA表达无影响.

关键词： 3,5,2',4'-四羟基查尔酮尿酸次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶磷酸核糖焦磷酸合成酶磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶

PRPS2在宫颈癌组织中的表达水平及抑癌机制分析

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

临床和实验医学杂志 2020年第8期19卷 829-833页

作者：袁佐杰沈军邹斌上海市崇明区第三人民医院检验科上海202153 上海市第一人民医院医学检验中心上海200080

目的分析磷酸核糖焦磷酸合成酶2(PRPS2)在宫颈癌中的表达情况及抑癌作用。方法上海市崇明区第三人民医院采集的66例宫颈癌患者癌组织及20份癌旁组织(距癌组织> 1 cm)标本,免疫组化法检测宫颈癌组织及癌旁组织PRPS2表达;并选择宫颈癌He... 详细信息

目的分析磷酸核糖焦磷酸合成酶2(PRPS2)在宫颈癌中的表达情况及抑癌作用。方法上海市崇明区第三人民医院采集的66例宫颈癌患者癌组织及20份癌旁组织(距癌组织> 1 cm)标本,免疫组化法检测宫颈癌组织及癌旁组织PRPS2表达;并选择宫颈癌He La细胞,脂质体转染PRPS2小干扰序列(He La-PRPS2组),并设计He La-NC对照组(转染无关siRNA序列)。蛋白印迹法(WB)测定PRPS2干扰效率,四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测细胞增殖情况,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力,流式细胞仪测定细胞凋亡情况,总结PRPS2抑癌机制。结果 ①宫颈癌癌组织PRPS2阳性率为75. 76%,高于癌旁组织25. 00%(P <0. 05);②He La-PRPS2组PRPS2蛋白表达量低于He La-NC对照组(P <0. 05);③He La-NC对照组干扰不同时间增殖活性均高于He La-PRPS2组(P <0. 05);④He La-NC对照组穿膜细胞比率高于He La-PRPS2组(P <0. 05);⑤转染后He La-NC对照组G0/G1期细胞比率高于He La-PRPS2组(P <0. 05),G2/M期细胞比率低于He La-PRPS2组(P <0. 05),细胞凋亡率低于He La-PRPS2组(P <0. 05)。结论宫颈癌癌组织PRPS2呈过表达,沉默宫颈癌细胞株He La PRPS2表达后细胞增殖、侵袭能力降低,细胞凋亡率增加,推测沉默PRPS2表达存在抑癌效应。

关键词：宫颈癌小干扰技术磷酸核糖焦磷酸合成酶 2 增殖侵袭凋亡