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生物工程学报 2023年第2期39卷 516-536页

作者：陈宇娴周楚然黄建忠陶勇柯崇榕杨欣伟福建师范大学生命科学学院工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心、工业微生物教育部工程中心福建福州350108 中国科学院微生物研究所北京100101

烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)作为辅酶Ⅰ(即NAD+)的关键前体之一,广泛存在于多种生物中,β异构体为其活性形式。研究表明β-NMN在多种生理代谢过程中起关键作用,作为抗衰老、改善退行性疾病和代谢性疾病的潜在活性... 详细信息

烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)作为辅酶Ⅰ(即NAD+)的关键前体之一,广泛存在于多种生物中,β异构体为其活性形式。研究表明β-NMN在多种生理代谢过程中起关键作用,作为抗衰老、改善退行性疾病和代谢性疾病的潜在活性物质,β-NMN的应用价值被深度发掘,实现规模化生产迫在眉睫。生物合成法因其具有高立体结构选择性、反应条件温和、副产物少等优点,成为合成β-NMN的首选方法。本文综述了β-NMN的生理活性、化学合成法和生物合成法,其中重点介绍生物合成法中涉及到的代谢途径,旨在探索利用合成生物学优化β-NMN生产策略的潜力,为β-NMN的代谢途径研究与高效生产提供理论基础。

关键词： β-烟酰胺单核苷酸烟酰胺核糖磷酸核糖焦磷酸化学合成生物合成

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过表达嘌呤合成途径关键酶基因对重组酿酒酵母菌株生产cAMP的影响

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过程工程学报 2014年第5期14卷 853-859页

作者：姬晓兵王凯陈洵天津大学化工学院天津300072

研究了环磷酸腺苷(cAMP)合成途径中的3个关键酶基因(磷酸核糖焦磷酸合成酶基因PRS1和PRS3、磷酸核糖焦磷酸氨基转移酶基因ADE4、腺苷酸激酶基因ADK1)过量表达对重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵向胞外分泌cAMP的影响,利用酿... 详细信息

研究了环磷酸腺苷(cAMP)合成途径中的3个关键酶基因(磷酸核糖焦磷酸合成酶基因PRS1和PRS3、磷酸核糖焦磷酸氨基转移酶基因ADE4、腺苷酸激酶基因ADK1)过量表达对重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵向胞外分泌cAMP的影响,利用酿酒酵母游离型质粒YEplac195和磷酸甘油酸激酶PGK的强启动子PGK1p及终止子PGK1t构建含PRS1,PRS3,ADE4和ADK1的单基因表达载体,分别转入cAMP生产菌GA125,通过摇瓶发酵实验考察重组菌株与对照菌株的生长、cAMP生产及胞外腺嘌呤消耗情况.结果表明,在外加腺嘌呤条件下,与对照菌株相比,PRS1,PRS3和ADE4基因过表达菌株的cAMP产量分别提高4.17%,9.03%和6.06%,而ADK1过表达菌株的cAMP产量降低3.85%.

关键词：酿酒酵母环磷酸腺苷腺嘌呤磷酸核糖焦磷酸

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生命物质-D-核糖

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山东食品发酵 2008年第2期 23-24页

作者：李宏李亮冀利山东省食品发酵工业研究设计院济南250013

简述D-核糖的形成机理,转化途径,作用及药理和部分实验进展情况。

关键词： D-核糖三磷酸腺苷磷酸核糖焦磷酸

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基于代谢工程的大肠杆菌中烟酰胺单核苷酸的合成

基于代谢工程的大肠杆菌中烟酰胺单核苷酸的合成

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作者：曹雨娟常州大学

学位级别：硕士

β-烟酰胺单核苷酸(NMN)是一种核苷酸化合物,是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的前体,存在于大多数生物体内。NMN会在体内转化成NAD+,从而参与生物体的运转。NAD+可直接或间接影响多种细胞过程,包括代谢途径、DNA修复和免疫细胞活动等。这... 详细信息

β-烟酰胺单核苷酸(NMN)是一种核苷酸化合物,是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的前体,存在于大多数生物体内。NMN会在体内转化成NAD+,从而参与生物体的运转。NAD+可直接或间接影响多种细胞过程,包括代谢途径、DNA修复和免疫细胞活动等。这些细胞过程在维持体内平衡方面起着至关重要的作用,但随着人们年龄的增长,组织和细胞内NAD+水平下降,这种NAD+水平的下降与许多与年龄相关的疾病有关。通过恢复NAD+水平,这些与年龄相关的疾病可以延迟甚至逆转。近年来NMN作为一种营养食品引起了人们的关注,大量数据表明,人体摄入NMN可以增加NAD+的浓度。在证明NMN摄入安全性的同时,研究发现其在预防、改善和治疗某些疾病中发挥重要作用,比如:2型糖尿病、肥胖症、心血管疾病、视力改善等。本课题基于代谢工程方法研究在大肠杆菌内全细胞合成NMN。这种全细胞的生物合成方法从廉价的原料底物葡萄糖和烟酰胺(NAM)开始,实现细胞内合成NMN。我们利用功能转运蛋白Niap和Pnu C分别用来转运NAM和NMN。细胞通过Niap摄取NAM,在烟酰胺磷酸核糖转移酶的催化下,与磷酸核糖焦磷酸(PRPP)为辅助因子将NAM高效的转化为NMN。PRPP由葡萄糖磷酸戊糖途径生成,经由zwf、pgl、gnd、Rpi A、Rpi B、prs、PRPS1/PRPS2催化生成,PRPP通路的构建是NMN在大肠杆菌体内合成的关键部分,生成的NMN通过Pnu C将NMN进行细胞外转运。烟酰胺磷酸核糖转移酶作为NMN合成通路中必不可少的酶,我们筛选了来自*** Nampt作为催化NMN合成的关键酶。此外,通过加强葡萄糖磷酸戊糖途径的代谢通量增强磷酸核糖焦磷酸(PRPP)的供应,该部分是细胞内NMN的合成是重要组成部分,我们构建了不同组合的PRPP通路以比较生产区别。在构建的不同NMN重组菌株组合中,我们发现中等生长条件质粒组合的菌株可以生产更多的NMN,该结论同样适用NMN在不同宿主中的产量。除此以外,我们还对比不同组合磷酸核糖焦磷酸酶对NMN合成的影响,发现PRPS1/2在摇瓶水平没有增加NMN的表达。在测试不同营养。不同生产方式后,最终,在烟酰胺(NAM)和葡萄糖的存在下,在大肠杆菌BL21(DE3)中,自动诱导方式生产8 hours,实现了NMN产率在摇瓶的生产水平达到1.26 g/L。这是至今为止摇瓶生产中产量最高的报导。

关键词： β-烟酰胺单核苷酸磷酸戊糖途径烟酰胺磷酸核糖转移酶磷酸核糖焦磷酸全细胞生物催化

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产β-烟酰胺单核苷酸大肠杆菌重组菌的构建及初步发酵工艺

产β-烟酰胺单核苷酸大肠杆菌重组菌的构建及初步发酵工艺

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作者：朱林锋广东药科大学

学位级别：硕士

目的与意义:β-烟酰胺单核苷酸（β-Nicotinamidemononucleotide,NMN）为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的前体,是一种具有广泛生物学活性的核苷酸化合物。通过口服NMN可以改善各种衰老相关疾病症状,包括肥胖症、糖尿病和神经退行性病变... 详细信息

目的与意义:β-烟酰胺单核苷酸（β-Nicotinamidemononucleotide,NMN）为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的前体,是一种具有广泛生物学活性的核苷酸化合物。通过口服NMN可以改善各种衰老相关疾病症状,包括肥胖症、糖尿病和神经退行性病变等,在临床、美容与保健领域具有重要应用价值。目前NMN的制备主要是通过化学合成的方法,因其昂贵的底物和催化剂导致NMN生产成本居高不下,并限制了其广泛的应用开发,因此需要更具成本效益的生产方法。在人类细胞中,NMN主要是由烟酰胺（Nicotinamide,NAM）和磷酸核糖基焦磷酸（phosphoribosyl pyrophos-phate,PRPP）通过NAD+挽救途径中的烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide phosphoribosyl transferase,Nampt）催化合成。NAM是一种可以工业化生产的低成本原料,而成本高昂的PRPP可以通过细胞内磷酸戊糖途径调控合成。因此,通过代谢工程改造微生物来建立NMN的绿色、廉价、高效生产系统是有可能的。大肠杆菌具有优良的工业发酵特性,也是最为成熟和常用的基因工程宿主系统,因此,我们拟利用大肠杆菌来构建NMN高效生产系统。研究内容和方法:1.工程菌的设计基于常用的大肠杆菌基因工程系统,根据NMN生物合成途经上调或引入关键的酶和运输蛋白,包括负责NMN合成的酶Nampt、摄取底物烟酰胺的运输蛋白Nia P、转出产物NMN的运输蛋白Pnu C、以及负责PRPP合成的几个关键酶。其中的Nampt、Nia P和Pnu C采用文献报道的异源蛋白,PRPP合拟成相关酶则来自大肠杆菌戊糖途径。戊糖途径由7个酶负责,选取其中的三个关键性基因[Zwf（6-磷酸葡萄糖脱氢酶）、Rpia（5-磷酸核糖异构酶A）、Prs（磷酸核糖焦磷酸激酶）]构建一个高效表达的人工操纵子。另外,为了提高工程菌的氧传递能力,拟引入透明颤菌血红蛋白基因（Vgb）。上述所有目的基因采用T7启动子驱动,宿主菌为大肠杆菌BL21（DE3）,以便构建诱导型高效表达系统。拟采用具有不同复制原点和双克隆位点的p RSFDuet-1、p CDFDuet-1与p ACYCDuet-1等三种相容性表达载体克隆所有目的基因于同一宿主细胞中,以便实现仅用一种工程细胞建立N简单、高效、廉价和易于工业化放大的NMN生产系统。2.目的基因合成与克隆（1）Nampt、NiaP、PnuC和Vgb基因合成与克隆根据文献报道的氨基酸序列,使用大肠杆菌偏爱密码子设计目的基因,委托武汉金凯瑞生物公司合成后克隆于T载体。（2）PRPP人工操纵子合成与克隆采用常规PCR法从大肠杆菌基因组DNA扩增Zwf、Rpia和Prs,采用重叠延伸PCR法组装人工操纵子。共设计正向拼接zwf→rpia→prs和反向拼接prs→rpia→zwf二种操纵子。各结构基因之间引入大肠杆菌的核糖体结合位点（RBS）,之后置于T7启动子下游。3.工程菌构建构建pRSFDuet-Nampt/pnuc、pCDFDuet-zwf→rpia→prs/Niap、p ACYCDuet-prs→rpia→zwf和p ACYCDuet-prs→rpia→zwf/vgb等4种表达载体,先分别克隆于大肠杆菌DH5α,PCR菌落鉴定重组子,DNA序列分析确证后共转化大肠杆菌BL21（DE3）,得PRCA1（p RSFDuet-Nampt/Pnu C+p CDFDuet-zwf→rpia→prs/Niap+p ACYCDuet-prs→rpia→zwf）和PRCA2（p RSFDuet-Nampt/Pnu C+p CDFDuet-zwf→rpia→prs/Niap+p ACYCDuet-prs→rpia→zwf/vgb）二种工程菌。4.工程菌目的基因表达分析工程菌37℃震荡培养至对数中期,加入IPTG30℃诱导14-16小时,目的基因在T7启动子驱动下高效表达,SDS-PAGE法分析目的基因表达情况。***生产与检测（1）工程菌生长曲线的测定将工程菌接种于LB液体培养基中,37℃震荡培养,每隔一小时取样测定OD,测定至8h。（2）NMN高产株筛选工程菌在摇瓶中培养至对数中期期加入IPTG,30℃诱导14-16小时。离心收集菌体,PBS洗涤后转换含烟酰胺的M9培养基,继续培养,每隔2h取1m L反应液,离心取上清测定NMN含量。（3）NMN生产条件优化筛选出高产量NMN重组菌后,对其诱导温度、pH和OD值进行梯度设置,优化出最适培养条件。（4）发酵罐发酵生产NMN工程菌采用5L全自动控制发酵罐进行甘油补料发酵,表达诱导8h后测定OD,按适当细胞密度浓缩,在M9反应培养基中合成NMN。（5）NMN含量测定采用HPLC法测定。***分析方法的

关键词：烟酰胺单核苷酸大肠杆菌烟酰胺磷酸核糖转移酶磷酸核糖焦磷酸转运蛋白透明颤菌血红蛋白

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PRPS1基因及其突变与相关临床综合征的研究进展

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国际输血及血液学杂志 2020年第1期43卷 82-88页

作者：杨怡李彦欣上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心血液/肿瘤科国家卫生和计划委员会儿童血液肿瘤重点实验室 200127

PRPS1基因编码的磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRS)1是参与核酸合成的第一限速酶,其对细胞功能,特别是嘌呤、嘧啶相关的合成、代谢等有重要影响。当PRPS1基因突变引起PRS1晶体结构改变时,其编码的PRS1活性也将发生改变,进而不仅会导致嘌呤和嘧... 详细信息

PRPS1基因编码的磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRS)1是参与核酸合成的第一限速酶,其对细胞功能,特别是嘌呤、嘧啶相关的合成、代谢等有重要影响。当PRPS1基因突变引起PRS1晶体结构改变时,其编码的PRS1活性也将发生改变,进而不仅会导致嘌呤和嘧啶代谢紊乱,还会引起细胞能量代谢紊乱。此外,遗传性PRPS1基因突变会引起高耗能组织器官的功能异常,出现一系列的临床综合征。在肿瘤患者中也存在体细胞的PRPS1基因突变,可引起肿瘤耐药复发。总之,PRS1在能量代谢、细胞信号转导及核酸合成等方面发挥关键作用,对维持人体正常生理活动具有重要意义。笔者拟就PRPS1基因编码的PRS1在人体的生理功能和晶体结构、PRPS1基因及其突变对细胞代谢的调节及PRPS1基因突变相关临床综合征等方面进行综述。

关键词：磷酸核糖焦磷酸综合征代谢磷酸核糖焦磷酸合成酶 PRPS1基因

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