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微生物磷脂酶c检测方法的研究进展

安徽农业科学 2010年第23期38卷 12412-12413页

作者：高林通标标准技术服务(上海)有限公司上海200233

介绍了磷脂酶c检测方法的研究进展,并对各检测方法的特点进行了比较。

关键词：磷脂酶c 检测卵黄平板

中国美利奴绵羊磷脂酶c zeta基因表达载体的构建及原核表达

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动物医学进展 2014年第12期35卷 104-109页

作者：木尔扎提.阿勒腾别克刘强贺志锐王银龙乌热力哈孜赛务加甫石河子大学动物科技学院新疆石河子832003

构建美利奴绵羊磷脂酶c zeta(PLcζ)融合蛋白表达载体,并在原核细胞内表达及纯化,为其特异性抗体的制备及生物学功能研究奠定基础。用PcR技术扩增出PLcζ基因片段,亚克隆到原核表达载体pczn1中,导入Arctic Express TM(DE3)感受态细胞,I... 详细信息

构建美利奴绵羊磷脂酶c zeta(PLcζ)融合蛋白表达载体,并在原核细胞内表达及纯化,为其特异性抗体的制备及生物学功能研究奠定基础。用PcR技术扩增出PLcζ基因片段,亚克隆到原核表达载体pczn1中,导入Arctic Express TM(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,收样后进行SDS-PAGE电泳或Western blot检验PLcζ的表达情况。用镍离子亲和层析的方法大量纯化融合蛋白。结果显示,重组质粒经PcR、酶切和测序鉴定证明载体构建正确。pczn1表达载体在Arctic Express TM(DE3)表达菌中能很好地表达融合蛋白。表达纯化后可获得了分子量约74ku的融合蛋白,符合预期大小。成功构建pczn1-PLcζ原核表达载体,表达并纯化了其融合蛋白,Western blot试验表明其蛋白分子的完整性良好,这将有利于对PLcζ蛋白进行深入的研究。

关键词：磷脂酶c zeta蛋白原核表达 Western blot

微生物产磷脂酶c的筛选、发酵优化及重组表达

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微生物产磷脂酶C的筛选、发酵优化及重组表达

作者：刘菲菲江南大学

学位级别：硕士

磷脂酶c(Phospholipase c，简称PLc)(Ec3.***.4.3)，是一种能够水解甘油磷脂c3位点磷酯酰键生成甘油二酯和磷酸胆碱、磷酸肌醇、磷酸乙醇胺等的脂类水解酶。随着对PLc研究的深入，磷脂酶c的应用范围已经逐渐从药品生产延伸至油脂精炼、食... 详细信息

磷脂酶c(Phospholipase c，简称PLc)(Ec3.***.4.3)，是一种能够水解甘油磷脂c3位点磷酯酰键生成甘油二酯和磷酸胆碱、磷酸肌醇、磷酸乙醇胺等的脂类水解酶。随着对PLc研究的深入，磷脂酶c的应用范围已经逐渐从药品生产延伸至油脂精炼、食品加工、磷脂改性等领域。本论文筛选出一株产磷脂酶c菌株，对其进行了发酵条件优化并克隆了其磷脂酶c基因，探索了其在大肠杆菌和毕赤酵母中的异源表达，具体研究结果如下：以卵黄为底物，从600株细菌中筛选到一株产磷脂酶c蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus12，采用单因素实验对其发酵条件进行优化，在接种量2%、装液量75mL/250mL三角瓶、200r/min、32℃、锌离子终浓度0.2mmol/L、卵黄添加量0.75%下酶活力达到23.78±0.32U/mL，较优化前提高了26.50%。以***12基因组DNA为模板，PcR扩增获得磷脂酰胆碱特异性磷脂酶c基因pcplc1(包含前肽)和pcplc2(不包含前肽);构建重组大肠杆菌表达质粒并转化***21(DE3)。经IPTG诱导，重组菌*** BL21(DE3)/pET28a-pcplc1表现出明显的磷脂酶c活性，SDS-PAGE显示重组蛋白相对分子量约33kDa。摇瓶条件下最佳诱导条件为：接种量4%、诱导起始时间1.5h、IPTG终浓度0.2mmol/L、25℃诱导4h，此时细胞破碎上清酶活达到30.24±0.18U/mL。对该重组磷脂酶c进行酶学性质研究，其最适作用温度为80℃，最适反应pH为6.8。酶液经40℃处理30min仍比较稳定，60℃以上处理30min后酶活力急剧下降。pH6.0.6环境下处理1h后剩余酶活力在80%以上，但是低于pH4.0或高于9.0酶活力损失较为严重。金属离子中cu2+对其有明显的抑制作用;Na+、Mg2+随着浓度的升高对其抑制作用加强;Zn2+、Mn2+对其具有明显的促进作用;Ni2+对酶的作用不是很明显。利用重组蛋白N端6HIS标签，对重组蛋白进行镍柱亲和层析，得到了SDS-PAGE电泳纯重组酶蛋白。以pPIc9K为载体构建重组毕赤酵母表达质粒pPIc9K-pcplc1和pPIc9K-pcplc2，选取SacI作为线性化酶切位点，转化毕赤酵母GS115和X-33。MD平板筛选阳性转化子，并经G418抗性梯度筛选多拷贝重组子，经PcR鉴定为甲醇快速利用型。30℃0.5%甲醇诱导48h，在硼砂卵黄平板上检测到了磷脂酶c活性，初步探讨了磷脂酶c基因在毕赤酵母中的表达。

关键词：磷脂酶c 克隆表达大肠杆菌优化毕赤酵母

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哈维氏弧菌磷脂酶c的分离纯化及性质研究

哈维氏弧菌磷脂酶C的分离纯化及性质研究

作者：李彩风中国海洋大学

学位级别：硕士

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)广泛存在于海洋环境中,属于条件致病菌,能引起世界范围内的海水鱼类及其他养殖动物发病,给水产养殖业造成巨大的经济损失。哈维氏弧菌的胞外分泌物如蛋白酶、溶血素、几丁质酶、脂酶和磷脂酶等毒力因子在致... 详细信息

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)广泛存在于海洋环境中,属于条件致病菌,能引起世界范围内的海水鱼类及其他养殖动物发病,给水产养殖业造成巨大的经济损失。哈维氏弧菌的胞外分泌物如蛋白酶、溶血素、几丁质酶、脂酶和磷脂酶等毒力因子在致病过程中起到重要作用。本论文从发病鲈鱼体内分离的致病菌哈维氏弧菌SF-1的胞外产物中首次分离纯化到一种磷脂酶c,并对其进行了理化性质及毒性试验研究。先后采用(NH4)2SO4分级盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤、再次DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析等方法从哈维氏弧菌SF-1菌株的上清液中分离纯化得到磷脂酶c。SDS-PAGE电泳显示该磷脂酶c呈现单一条带,分子量约为64 kDa。通过Sephadex G-200凝胶过滤层析柱标定的磷脂酶c的分子量为65 kDa,两者的结果一致,表明该酶是单体蛋白质。硅胶板薄层层析方法显示纯化的磷脂酶酶c和标准磷脂酶c(clostridium. perfringens )对磷脂酰胆碱底物的水解产物相同,即该酶的水解特性与标准磷脂酶c相一致,表明该酶属于磷脂酶c。对酶进行理化性质的研究表明:该磷脂酶的最适作用温度为50℃,最适反应pH值为8.0,当温度超越40℃时,酶活性迅速下降,表明该酶是热不稳定的蛋白质,在pH7.0时,酶活力比较稳定,当pH在8.0以上时,磷脂酶c活力急剧下降。1mmol/L的co2+,ca2+对酶活性有促进作用,1mmol/L的Zn2+和Mg2+对酶活性有明显抑制作用。0.1mmol/L的SDS,EGTA,EDTA对酶活性都有抑制作用,但是PMSF对酶活性没有明显影响。对磷脂酶c进行化学修饰研究,10mmol/L的TNBS与该酶反应后,磷脂酶的活性完全丧失,表明赖氨酸残基是保持酶催化活性的必需基团;EDAc修饰该酶后,酶活性有所降低,表明天冬氨酸残基或谷氨酸残基对保持酶的催化活性有一定作用;巯基乙醇与该酶反应后,酶活性大大降低,表明该酶中存在的二硫键对

关键词：哈维氏弧菌磷脂酶c 分离纯化性质毒性

乙酸钙不动杆菌磷脂酶c的功能分析及应用研究

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乙酸钙不动杆菌磷脂酶C的功能分析及应用研究

作者：王爽天津科技大学

学位级别：硕士

磷脂酶c(Phospholipase,PLc)能够水解甘油磷脂sn-3位的甘油磷酸酯键,生成甘油二酯和磷酸化合物。目前,PLc的研究较少,主要应用于油脂脱胶工业,不能满足各个行业的需求,造成其在应用上的局限。本研究拓展了其应用领域,为PLc的研究奠定基... 详细信息

磷脂酶c(Phospholipase,PLc)能够水解甘油磷脂sn-3位的甘油磷酸酯键,生成甘油二酯和磷酸化合物。目前,PLc的研究较少,主要应用于油脂脱胶工业,不能满足各个行业的需求,造成其在应用上的局限。本研究拓展了其应用领域,为PLc的研究奠定基础。本研究的主要内容及结果如下:本研究从土壤中筛选获得一株产磷脂酶的菌株,经16S r DNA鉴定后,通过构建系统发育树鉴定该菌株为乙酸钙不动杆菌,并命名为Acinetobacter calcoaceticus Tccc112146。扩增*** Tccc 112146的PLc基因(plc),与载体pPIc9K连接,构建重组质粒pPIc9k-plc,经测序分析,plc的基因片段长度为2229 bp,编码742个氨基酸。在毕赤酵母中表达重组游离PLc(f PLc)并进行纯化,对f PLc的酶学性质进行分析发现:以p-NPPc为底物其最适反应条件为50℃、p H 9.0,在50℃以下、p H8.0-10.0范围内具有良好的稳定性;f PLc的K/K为178.26 1/m M/s;通过f PLc对不同结构磷脂的底物特异性研究,发现其更倾向于水解头部为磷酸乙醇胺的磷脂;将plc基因与毕赤酵母表面展示载体pKFS连接,构建重组质粒pKFS-plc,并将其转化至毕赤酵母感受态GS115中,构建细胞表面展示PLc毕赤酵母重组菌株GS115/pKFS-plc,得到重组表面展示PLc(d PLc),对d PLc全细胞催化剂的酶学性质进行分析发现:d PLc的最适温度为50℃、最适p H值为9.0;d PLc在60℃以下,p H 8.0-10.0范围内稳定,稳定性得到提升。对dPLc催化鞘磷脂合成神经酰胺的条件进行优化,最适催化条件为:底物添加量5.0 mg/m L、d PLc酶添加量为3000 U、反应温度40℃、p H 8.0、反应时间4 h,神经酰胺产率到达51%;d PLc重复利用7个批次后,神经酰胺的相对产率仍可达到初始反应批次的51%。

关键词：乙酸钙不动杆菌磷脂酶c 重组表达酶学特性毕赤酵母表面展示神经酰胺

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禾谷镰刀菌磷脂酶c1基因的克隆与功能分析

禾谷镰刀菌磷脂酶C1基因的克隆与功能分析

作者：张洪滨山东农业大学

学位级别：硕士

小麦赤霉病是一种世界性的病害,它能造成包括大麦、小麦等禾谷类作物产量上极大的损失。小麦赤霉病主要发生在我国的中部和长江中下游流域,在长江中下游地区病害发生的频率最高且程度最重。随着耕作制度以及气候的变化,小麦赤霉病有大... 详细信息

小麦赤霉病是一种世界性的病害,它能造成包括大麦、小麦等禾谷类作物产量上极大的损失。小麦赤霉病主要发生在我国的中部和长江中下游流域,在长江中下游地区病害发生的频率最高且程度最重。随着耕作制度以及气候的变化,小麦赤霉病有大规模严重发生的可能。研究表明,我国小麦赤霉病的流行范围已经开始向山东等北部省份转移,山东省的小麦赤霉病主要优势种群为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum),它是我国小麦赤霉病的主要病原物。F. graminearum产生的单端孢霉烯族毒素DON以及它的衍生物3-ADON和15-ADON极大的威胁人畜的生命健康并影响籽粒的食用价值,但是对禾谷镰刀菌的产毒机理及致病机制的研究还相对较少。对磷脂酶c的研究发现它在磷脂信号途径中扮演着非常重要的角色,它能催化细胞膜上一系列的合成与降解反应。通过催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(phosphatidylinositol4,5-biphosphate, PIP2)水解产生二酯酰甘油(diacylglycerol, DAG)和三磷酸肌醇(trisphosphate inositol, IP3)。 IP3能够诱导细胞内钙池中的ca2+释放出来,DAG则能够直接激活钙调蛋白介导激活的ca2+依赖性蛋白激酶c (Protein kinase c, PKc).磷脂酶c的典型结构包括一个氮端PH结构域、碳端的c2催化区、EF手型结构域和高度保守的X区和Y区。目前已知真菌PLc都属于PLc6型。本实验以禾谷镰刀菌(F. graminearum)菌株01-3做为实验材料,通过NcBI的Blast、conserved Domain Search Genebank及DNAMAN等生物学网站和软件对禾谷镰刀菌基因组数据库中的PLcs进行了分析;并设计针对禾谷镰刀菌PLc1基因的特异性引物,克隆得到FgPLc1基因;然后构建了FgPLc1基因的敲除载体和回复载体,通过聚乙二醇介导原生质体转化的方法获得了FgPLc1基因敲除突变体和回复突变体;通过对FgPLc1基因敲除突变体和回复突变体表型和毒素含量进行分析,明确了FgPLcl基因在禾谷镰刀菌生长、产孢以及毒素合成等过程中的作用。所得结果如下：1.通过NcBI Blast功能找到了5个禾谷镰刀菌PLc基因,确定了它们在染色体上的位置,各个基因所具有的结构,然后将各个基因分别命名为PLc1、PLc2、PLc3、PLc4、PLc5。根据禾谷镰刀菌PLcl基因序列设计特异性引物,克隆得到禾谷镰刀菌PLc1基因(FgPLc1)。再通过NcBI conserved Domain Search匕较分析,发现禾谷镰刀菌PLc1的结构与稻瘟病菌PLc1最为相似,都包含PH区,EF手型区、c2结构域、X区和Y区。2.根据禾谷镰刀菌基因组序列设计引物,以质粒pcB1003为基础,以潮霉素抗性基因为遗传标记,通过Overlap技术连接基因敲除同源臂,构建禾谷镰刀菌PLc1基因敲除载体pMDa+b+H。制备了禾谷镰刀菌野生型菌株原生质体,用构建好的敲除质粒聚乙二醇介导转化野生型菌株原生质体,得到禾谷镰刀菌PLc1基因敲除转化子,验证正确后,确定得到禾谷镰刀菌基因敲除突变体△FgPLc1。3.以质粒pcB1532作为基础,构建了FgPLc1基因回复载体,以回复载体质粒转化禾谷镰刀菌基因敲除突变体原生质体,筛选得到禾谷镰刀菌PLc1基因回复转化子,PcR和RT-PcR验证正确后,确定得到禾谷镰刀菌基因回复突变体△FgPLc1-c。4.通过对比野生型菌株和突变体菌株在生长、产孢、基因表达、毒素合成等方面的变化发现,禾谷镰刀菌PLc1基因敲除突变体与野生型相比,气生菌丝数量明显减少,生长速率减慢,菌落颜色变浅;相对于野生型菌株,敲除突变体菌株在氯化钠和刚果红培养基上的生长均受到了抑制,抑制率分别为48.4%、28.2%。在加有过氧化氢的培养基上,敲除突变体菌株受到的抑制率相对于野生型变小,其抑制率为4.4%。与在PDA培养基上的生长相比,在山梨醇培养基上,野生型菌株的生长受到了促进,敲除突变体的生长受到了抑制,抑制率为6.64%;分生孢子产量增大,敲除突变体菌株所产分生孢子的数量约为野生型菌株的两倍;此外敲除突变体分生孢子的长度和宽度均变小,分别比野生型菌株减少了82.5%和35.4%,敲除突变体不能像野生型菌株一样产生正常的有性孢子;敲除突变体Tri5、Tri6基因的表达量也都降低,其中Tri5基因的表达量较野生型下降了78%,Tri6基因的表达量较野生型下降了97%;DON的产量也有所下降,敲除突变体菌株所产DON的含量比野生型菌株减少了76.5%。回复PLc1基因后,这些敲除突变体所产生的变化基本都能能得到恢复。实

关键词：禾谷镰刀菌磷脂酶c 基因功能毒素合成

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产磷脂酶c菌株的筛选及其酶学性质的研究

产磷脂酶C菌株的筛选及其酶学性质的研究

作者：詹逸舒湖南农业大学

学位级别：硕士

神经酰胺(ceramides)是一种脂类二级信使,广泛参与了细胞的增殖、分化、细胞周期抑制、衰老和细胞凋亡,在医药、食品和化妆品方面具有极大的市场潜力和附加值。由于魔芋飞粉中神经酰胺与磷酸胆碱以鞘磷脂形式结合存在于细胞膜中,从中直... 详细信息

神经酰胺(ceramides)是一种脂类二级信使,广泛参与了细胞的增殖、分化、细胞周期抑制、衰老和细胞凋亡,在医药、食品和化妆品方面具有极大的市场潜力和附加值。由于魔芋飞粉中神经酰胺与磷酸胆碱以鞘磷脂形式结合存在于细胞膜中,从中直接提取神经酰胺得率低,严重影响了魔芋神经酰胺产业化开发的进程,而通过磷脂酶c酶解魔芋鞘磷脂,体外制备神经酰胺的是解决这一问题的有效途径之一。为解决神经酰胺体外生物制备中的技术瓶颈,本文从神经酰胺制备所需磷脂酶c的酶源入手,利用微生物繁殖快、易培养、酶产量高的特点,对产磷脂酶c筛选及初步鉴定,并在此基础上对其产酶条件、所产磷脂酶c的分离纯化及部分酶学性质进行了研究,从而为今后将磷脂酶c开发魔芋神经酰胺类物质打下坚实基础。主要研究结果如下：1.产磷脂酶c菌株筛选及初步鉴定采用卵黄平板法初筛,卵黄杯碟法、生物量及NPPc法复筛,分离得到一株产磷脂酶c菌株Z-13;通过菌株的个体形态学特征和群体形态学特征、生理生化特性,初步鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus Z-13)。2.产磷脂酶c菌株B. cereus Z-13产酶条件优化以生物量和磷脂酶c酶活为主要指标,采用单因素优化方法结合均匀设计试验,对B. cereus Z-13产磷脂酶c (phospholipase c,PLc)条件进行了优化,结果表明,魔芋飞粉2.5 g/L、黄豆粉30 g/L、K2HP04·3H2O2.8 g/L、Zn2S04-7H2O1.3g/L、接种量1.0%、摇床转速150 r/min、培养温度32℃、初始pH值9.0,在此条件下培养15 h,活菌总数为4.5×109cFU/mL,卵黄琼脂杯碟法测定磷脂酶c产生的沉淀圈(乳白色晕圈)直径可达30mm,液体摇瓶发酵磷脂酶c活力达23.31 U/ml。3.B. cereus Z-13磷脂酶c分离纯化采用硫酸铵沉淀及透析、DEAE-52离子交换层析、琼脂糖凝胶6B层析、Sephadex G-75凝胶过滤等方法对*** Z-13分泌磷脂酶c进行分离纯化研究,并利用Native-PAGE和SDS-PAGE对酶纯度及亚基分子量的测定,纯化倍数39.98倍,比活力135.15 U/mg蛋白,酶活回收率为20.93%;Native-PAGE和SDS-PAGE表明纯化后的磷脂酶c由一种亚基组成,分子量约为34 Ku。*** Z-13磷脂酶c部分酶学性质*** Z-13磷脂酶c最适作用温度为55℃,最适反应pH值为7.5,当温度超越60℃时,酶活性迅速下降,表明该酶是热不稳定的蛋白质,在pH6.0-8.0时,相对酶活力比较稳定,当pH在6.0以下时,磷脂酶c活力急剧下降。Zn+2、ca+2、Mg+2不同程度的对该酶有激活作用,Mn+2、cu+2则对酶活有抑制作用。*** Z-13磷脂酶c降解魔芋飞粉鞘磷脂制备神经酰胺采用双液相反应体系,以魔芋飞粉脂类粗提物为底物,*** Z-13发酵产磷脂酶c,定向水解鞘磷脂产生游离神经酰胺,HPLc-ELSD测定其含量为神经酰胺含量为0.725 mg/ml,比直接提取法提高到2.9%。

关键词：磷脂酶c 蜡状芽孢杆菌魔芋飞粉神经酰胺

金黄色葡萄球菌磷脂酶c克隆表达及其脱胶应用

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粮食与油脂 2014年第4期27卷 10-14页

作者：余榛榛芮丽莲梁丽常明王兴国江南大学食品学院食品科学与技术国家重点实验室食品安全与营养协同创新中心江苏无锡214122

该实验对金黄色葡萄球菌磷脂酶c(phospholipase c,PLc)基因在大肠杆菌(*** BL21(DE3))中进行重组表达。通过发酵优化,最终在30℃条件下,利用0.001 mmol/L IPTG诱导表达10 h,重组酶活达到47.4 U/mL。利用该重组PLc对大豆毛油进行脱胶处理... 详细信息

该实验对金黄色葡萄球菌磷脂酶c(phospholipase c,PLc)基因在大肠杆菌(*** BL21(DE3))中进行重组表达。通过发酵优化,最终在30℃条件下,利用0.001 mmol/L IPTG诱导表达10 h,重组酶活达到47.4 U/mL。利用该重组PLc对大豆毛油进行脱胶处理,确定了最佳脱胶条件为:50℃、1 200 U/kg油、pH 4.7,反应时间2 h,最终可使大豆毛油中磷含量从266 mg/kg降低至3.5 mg/kg,能够完全满足物理精炼要求。金黄色葡萄球菌磷脂酶c的重组表达及其在大豆毛油的脱胶应用为酶法脱胶技术的开发提供了理论支持。

关键词：磷脂酶c 金黄色葡萄球菌重组表达大豆毛油脱胶

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植物磷脂酶c的功能研究进展

生命科学 2017年第6期29卷 575-581页

作者：黄冬吴燕武汉大学生命科学学院杂交水稻国家重点实验室武汉430072

磷脂酶c(phospholipase c,PLc)是一类重要的水解酶,根据作用底物的不同可主要区分为磷脂酰肌醇特异性磷脂酶c(phosphoinositide-specific PLc,PI-PLc)和非特异性磷脂酶c(non-specific PLc,NPc)。在植物细胞的信号转导中,PLc及其产物均... 详细信息

磷脂酶c(phospholipase c,PLc)是一类重要的水解酶,根据作用底物的不同可主要区分为磷脂酰肌醇特异性磷脂酶c(phosphoinositide-specific PLc,PI-PLc)和非特异性磷脂酶c(non-specific PLc,NPc)。在植物细胞的信号转导中,PLc及其产物均发挥重要的媒介作用。不同于动物细胞,植物细胞中的六磷酸肌醇(inositol hexaphosphate,IP_6)和磷脂酸(phosphatidic acid,PA)被认为是传递植物磷脂信号的主要成员。现概述磷脂酶c的结构、家族成员的分类以及它们在细胞信号转导过程中发挥的作用,并对相关领域今后的研究方向提出展望。

关键词：磷脂酶c 三磷酸肌醇六磷酸肌醇磷脂酸信号转导