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磷脂酶a1高产菌株的筛选及其等离子体诱变

中国生物制品学杂志 2013年第11期26卷 1656-1662页

作者：马琦亚薛正莲苏燕南王洲赵世光安徽工程大学生物与化学工程学院微生物发酵安徽省工程技术研究中心安徽芜湖241000

目的从富油土壤中筛选磷脂酶a1高产菌株,优化其发酵条件,并经等离子诱变提高其产酶能力。方法用筛选培养基和发酵培养基分别对富油土壤中磷脂酶a1产生菌进行初筛和复筛,经气相色谱鉴定产酶类型;对获得的高产菌株进行形态、生理生化特征... 详细信息

目的从富油土壤中筛选磷脂酶a1高产菌株,优化其发酵条件,并经等离子诱变提高其产酶能力。方法用筛选培养基和发酵培养基分别对富油土壤中磷脂酶a1产生菌进行初筛和复筛,经气相色谱鉴定产酶类型;对获得的高产菌株进行形态、生理生化特征和分子生物学鉴定;优化该菌株的发酵时间,温度,pH值及摇床转速;从该菌株出发进行等离子体诱变,绘制致死率曲线,进行平板初筛及摇瓶复筛,并检测获得菌株的遗传稳定性。结果经初筛和复筛,获得1株磷脂酶a1高产菌株W22,经气相色谱鉴定其产酶为磷脂酶a1;该菌株在普通琼脂培养基上呈圆形,质地软,表面光滑、扁平,乳白色,晕圈明显,为芽孢杆菌属蜡样芽孢杆菌;最佳发酵条件为:发酵时间12 h,初始pH 8.0,温度32℃,摇床转速200 r/min,优化后酶活为9.12 U/ml,较优化前(6.74 U/ml)提高了35.3%;等离子体诱变后,经平板及摇瓶筛选,获得的菌株W22-5酶活最高,为12.80 U/ml,较诱变前(9.12 U/ml)提高了89.91%,且具有良好的遗传稳定性。结论成功获得1株磷脂酶a1高产菌株W22,优化了该菌的发酵条件,且经等离子诱变进一步提高了菌株的产酶能力,为磷脂酶a1的生产和应用奠定了基础。

关键词：磷脂酶a1 筛选等离子体诱变

磷脂酶a1催化水解大豆油制备甘油二酯研究(Ⅲ)--产品分析与检测

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中国油脂 2008年第9期33卷 29-32页

作者：汪勇谢林云欧仕益赵谋明华南理工大学轻工与食品学院广州510641 暨南大学食品科学与工程系广州510632

用高效液相色谱(HPLC)分析了大豆油和经过磷脂酶a1催化水解、分子蒸馏纯化的甘油二酯产品中甘油酯的含量,用折光指数检测器(RID)测定水解产品甘油二酯含量为42.64%,通过高效液相色谱电喷雾(ESI)质谱(MS)联用分析了甘油酯的组成。用气相... 详细信息

用高效液相色谱(HPLC)分析了大豆油和经过磷脂酶a1催化水解、分子蒸馏纯化的甘油二酯产品中甘油酯的含量,用折光指数检测器(RID)测定水解产品甘油二酯含量为42.64%,通过高效液相色谱电喷雾(ESI)质谱(MS)联用分析了甘油酯的组成。用气相色谱分析了大豆油、分子蒸馏轻相脂肪酸及水解产品的脂肪酸组成。结果发现,和原料大豆油相比,磷脂酶a1催化水解得到的脂肪酸中棕榈酸含量显著提高。

关键词：甘油二酯磷脂酶a1 HPLC—MS 脂肪酸组成

磷脂酶a1催化水解大豆油制备甘油二酯研究(Ⅱ)——分子蒸馏纯化产品

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中国油脂 2008年第8期33卷 37-39页

作者：汪勇谢林云欧仕益赵谋明华南理工大学轻工与食品学院广州510641 暨南大学食品科学与工程系广州510632

大豆油经磷脂酶a1催化水解生成甘油二酯和脂肪酸。在不同的温度下,用分子蒸馏除去粗甘油二酯中的脂肪酸。研究结果表明,在135℃,真空度1 Pa,刮膜速率250 r/min下进行两次分子蒸馏,可以得到酸值(KOH)为0.77 mg/g,碘值(I)为138.20 g/100 ... 详细信息

大豆油经磷脂酶a1催化水解生成甘油二酯和脂肪酸。在不同的温度下,用分子蒸馏除去粗甘油二酯中的脂肪酸。研究结果表明,在135℃,真空度1 Pa,刮膜速率250 r/min下进行两次分子蒸馏,可以得到酸值(KOH)为0.77 mg/g,碘值(I)为138.20 g/100 g的甘油二酯产品。分子蒸馏得到的轻相与原料大豆油相比,碘值下降,饱和度提高。

关键词：大豆油磷脂酶a1 分子蒸馏甘油二酯

磷脂酶a1催化水解大豆油制备甘油二酯研究(Ⅰ)——水解条件优化

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中国油脂 2008年第7期33卷 37-39页

作者：谢林云汪勇欧仕益刘启东暨南大学食品科学与工程系广州510632 东莞中谷油脂有限公司广东东莞523147

以大豆油为原料,经磷脂酶a1催化水解甘油三酯,生成甘油二酯与脂肪酸。研究了水解时间、水解温度、加酶量和加水量对酶解反应的影响。通过正交试验得出磷脂酶a1水解大豆油的最佳反应条件为:水解温度35℃,加酶量26U/g,加水量40%,水解时间8... 详细信息

以大豆油为原料,经磷脂酶a1催化水解甘油三酯,生成甘油二酯与脂肪酸。研究了水解时间、水解温度、加酶量和加水量对酶解反应的影响。通过正交试验得出磷脂酶a1水解大豆油的最佳反应条件为:水解温度35℃,加酶量26U/g,加水量40%,水解时间8h。在此条件下,水解物酸值(KOH)达58.07mg/g。

关键词：甘油二酯大豆油磷脂酶a1 水解

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磷脂酶a1水解蛋黄卵磷脂的研究

中国油脂 2008年第2期33卷 29-33页

作者：周瑢朱启思黏慧青杨继国王永华杨博华南理工大学生物科学与工程学院中国科学院广州地球化学研究所有机地球化学国家重点实验室广州510640 华南理工大学轻工与食品学院广州510640

采用磷脂酶a1水解蛋黄卵磷脂,通过单因素实验和正交实验确定该酶水解蛋黄卵磷脂经济合理的工艺条件为:反应温度50℃,反应时间5 h,加酶量0.40 IU/g,起始pH 6.0,底物质量浓度80 g/L;利用电喷雾飞行时间质谱仪分析水解前后蛋黄卵磷脂组分,... 详细信息

采用磷脂酶a1水解蛋黄卵磷脂,通过单因素实验和正交实验确定该酶水解蛋黄卵磷脂经济合理的工艺条件为:反应温度50℃,反应时间5 h,加酶量0.40 IU/g,起始pH 6.0,底物质量浓度80 g/L;利用电喷雾飞行时间质谱仪分析水解前后蛋黄卵磷脂组分,磷脂酶a1水解Sn-1位脂肪酸,生成含Sn-2位不饱和脂肪酸的溶血磷脂,反应过程中有酰基位移发生。

关键词：磷脂磷脂酶a1 溶血磷脂磷脂改性电喷雾飞行时间质谱

磷脂酶a1的固定化及其催化合成DHA/EPA型磷脂的研究

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磷脂酶A1的固定化及其催化合成DHA/EPA型磷脂的研究

作者：李响华南理工大学

学位级别：硕士

磷脂是一类自然界中广泛存在的功能性脂质,具有良好的理化特性和生理功能,已被广泛应用于食品、医药、化妆品等行业。不同结构的磷脂具有不同的生理功能,因此,开发不同结构特性的磷脂具有非常重要的意义。磷脂改性的方法有多种,其中酶... 详细信息

磷脂是一类自然界中广泛存在的功能性脂质,具有良好的理化特性和生理功能,已被广泛应用于食品、医药、化妆品等行业。不同结构的磷脂具有不同的生理功能,因此,开发不同结构特性的磷脂具有非常重要的意义。磷脂改性的方法有多种,其中酶法磷脂改性能够保持磷脂的天然构型,是目前研究的热点之一。DHA/EPA是公认的功能性多不饱和脂肪酸,在人类健康预防和疾病治愈方面都有着很好地效果。目前,可以被人体摄入的DHA/EPA的形式包括四种:游离脂肪酸型、乙酯型、甘油三酯型以及磷脂型。游离型的DHA/EPA最容易被人体吸收,但是游离型的DHA/EPA容易被氧化,而且酸臭味大。近年来,人们发现同乙酯型和甘油三酯型相比,磷脂型的DHA/EPA在人体中更容易吸收,生物利用度更高。本研究以固定化磷脂酶a1为催化剂,催化富含DHA/EPA的乙酯和卵磷脂(PC)酯交换反应制备DHA/EPA型磷脂。主要的研究结果如下:1.对磷脂酶a1进行固定化。结果表明,D380树脂是从5种树脂中筛选出的具有最佳固定化效果的载体。最优地固定化的条件为:树脂/原酶液值为1:3,缓冲液p H=5.0,吸附温度30℃,吸附6h,在此条件下得到的固定化酶的蛋白吸附量为36.96mg/g,磷脂酶活力为为720.95U/g。2.固定化磷脂酶a1催化乙酯和PC制备DHA/EPA型磷脂。通过单因素优化得到的最佳的优化条件为:加酶量15%(相对于底物总质量),底物质量比(PC/乙酯)1:6,反应温度55℃,加水量1.25%(相对于底物总质量)。此时,最大的DHA/EPA结合率为30.7%,产物中的磷脂组成为16.5%PC,26.3%1-LPC,31.4%2-LPC和25.8%GPC。此外,通过固定化酶重复使用实验,确认固定化磷脂酶a1重复使用性好,重复六次使用后,残存的酶活力仍可达到48.9%。3.响应面法分析酯交换反应。当仅考虑结合率时,最优化的条件为:反应温度57.5℃,加水量1.28%,底物质量比(PC/乙酯)1:6.8,结合率为31.0%。此时,产物中磷脂组成为:15.2%PC、58.1%LPC、26.7%GPC。当同时考虑结合率和PC产率时,最优化的条件为:反应温度56.9℃,加水量1.10%,底物质量比(PC/乙酯)1:7,结合率为29.6%。此时,磷脂组成为:21.7%PC、54.6%LPC、23.7%GPC。当同时考虑结合率和LPC产率时,最优化的条件为:反应温度57.4℃,加水量1.36%,底物质量比(PC/乙酯)1:6.4,结合率为30.7%。此时,磷脂组成为:12.8%PC、59.0%LPC、28.2%GPC。另外,由图1、2、3和结构式4-1可以看出,反应12h之前,产物中富含DHA/EPA的PC和1-LPC占主导,然而反应继续进行后,富含DHA/EPA的2-LPC和GPC占主导地位。

关键词：磷脂酶a1 固定化 PC DHA/EPA 酯交换反应

磷脂酶a1产生菌的筛选、重组大肠杆菌的构建及自诱导发酵

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磷脂酶A1产生菌的筛选、重组大肠杆菌的构建及自诱导发酵

作者：延晋雷江南大学

学位级别：硕士

磷脂酶A(Phospholipase A，简称PLA，EC3.***.1.32)能特异性水解多种磷脂Sn-1位上的脂肪酸，生成游离脂肪酸和溶血性磷脂。近年来，市场上已经出现多种磷脂酶A产品，并在油脂脱胶、医药、皮革及食品加工等行业得到广泛推广，应用前景广阔... 详细信息

磷脂酶A(Phospholipase A，简称PLA，EC3.***.1.32)能特异性水解多种磷脂Sn-1位上的脂肪酸，生成游离脂肪酸和溶血性磷脂。近年来，市场上已经出现多种磷脂酶A产品，并在油脂脱胶、医药、皮革及食品加工等行业得到广泛推广，应用前景广阔。国内外对磷脂酶A的研究起步较晚，目前发现产磷脂酶A的微生物仅有少数几个属种，且酶活较低。本研究采用特殊的平板显色法筛选出高产磷脂酶A的菌株，并克隆到细菌Serratialiquefacien的磷脂酶A基因。利用乳糖自诱导技术实现了重组大肠杆菌产磷脂酶A的高效分泌表达，并对重组菌的诱导和发酵条件进行了一系列研究，确定了重组菌在摇瓶水平产酶的最佳条件。最后利用亲和层析技术，纯化到重组磷脂酶A，进行了酶学性质和底物特异性的研究。本论文的具体研究结果如下： (1)从600余株细菌中筛选出4株高产磷脂酶A的菌株：Xanthomonas retroflexus，Serratia liquefacien，Citrobacter youngae和Shewanella putrefaciens。通过PCR方法克隆到S. liquefaciens编码磷脂酶A的基因pla;经测序后与NCBI数据库中已知的磷脂酶A比对，基因序列和氨基酸序列同源性最高分别为92.0%和92.8%。 (2)为研究大肠杆菌分别在PelB信号肽和原始信号肽的介导下分泌表达磷脂酶A的效果，构建了两株重组菌E. coli BL21(DE3)/pET20b-dpla和BL21(DE3)/pET28a-pla。结果显示，磷脂酶A在原始信号肽的介导下获得了高效分泌表达，胞外酶的酶活最高达248±10U/mL，占总酶活的91.1%。研究了不同诱导方式对工程菌E. coliBL21(DE3)/pET28a-pla产磷脂酶A的影响。在乳糖自诱导获得的生物量和胞外酶水平分别是传统IPTG最佳诱导条件下的2.6和3.2倍。继续进行培养基和发酵条件研究，在初始培养基中分别添加5g/L甘油，10g/L蛋白胨和5g/L酵母粉，种龄6h，37℃恒温发酵30h，胞外磷脂酶A的酶活最高可达512±18U/mL，比优化前提高了62.3%。 (3)在摇瓶水平优化的基础上，对工程菌在7L发酵罐水平进行发酵产酶条件的验证，控制通气量1.5vvm，pH7.2，转速耦连溶氧维持在30%。分批发酵结果显示，胞外磷脂酶A在发酵20h时达619±27U/ml，是摇瓶水平的1.21倍。继续进行分批-补料发酵，待培养基中碳源耗尽后流加50%的甘油并控制终浓度小于2g/L，接种5h流加诱导剂乳糖;结果显示，在发酵28h时胞外磷脂酶A的酶活最高达922±32U/mL，是摇瓶水平的1.81倍。 (6)通过亲和层析纯化得到电泳纯的磷脂酶A，酶学性质研究显示：重组酶的最适反应温度为50℃，在70℃条件下维持1h仍保留60%以上的酶活;最适反应pH为6.5，在pH5范围内酶稳定性较好。5mmol/L的Li+、Cu、Mn和化学试剂EDTA，SDS以及Tween20对其有明显的抑制作用，Ca、Ni和Mg对其具有一定的促进作用。重组磷脂酶A具有较宽泛的底物特异性，且脂肪酶活力较低。

关键词：磷脂酶a1 大肠杆菌乳糖自诱导酶学性质

磷脂酶a1催化水解大豆油制备甘油二酯的研究

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磷脂酶A1催化水解大豆油制备甘油二酯的研究

作者：谢林云暨南大学

学位级别：硕士

甘油二酯(Diacylglycerol,DAG)简称甘二酯,是由甘油与两个脂肪酸酯化后得到的产物,主要有两种异构体:1,3-甘油二酯与1,2-甘油二酯。甘油二酯是天然植物油脂的微量成分及体内脂肪代谢的内源中间产物,2000年获得美国FDA食品安全审查,通过... 详细信息

甘油二酯(Diacylglycerol,DAG)简称甘二酯,是由甘油与两个脂肪酸酯化后得到的产物,主要有两种异构体:1,3-甘油二酯与1,2-甘油二酯。甘油二酯是天然植物油脂的微量成分及体内脂肪代谢的内源中间产物,2000年获得美国FDA食品安全审查,通过了GRAS认证即“Generally Recognize As Safe”,是公认安全的食品成分。近年来发现,膳食DAG具有减少内脏脂肪、抑制体重增加、降低血脂等作用,因而受到广大学者的关注。以大豆油为原料,经磷脂酶a1催化水解甘油三酯,生成甘油二酯与脂肪酸。研究了水解时间、水解温度、加酶量和加水量对酶解反应的影响。通过正交实验得出磷脂酶a1水解大豆油的最佳反应条件为:水解温度35℃、加酶量26 u/g、加水量40%,水解时间8h。在此条件下,水解酸值达58.07mgKOH/g。大豆油经磷脂酶a1催化水解生成甘油二酯与脂肪酸。在不同的温度下,用分子蒸馏除去粗甘油二酯中的脂肪酸。结果表明:在135℃,真空度1Pa,刮膜速率250r/min下进行两次分子蒸馏,可以得到酸值为0.77 mgKOH/g,碘值为138.20 gI/100g的甘油二酯产品。分子蒸馏得到的轻相和原料大豆油相比,碘值下降饱和度提高。分子蒸馏得到的产品,通过HPLC-UV法和HPLC-RID法测定了原料大豆油和分子蒸馏甘油二酯产品的甘油酯组成和含量。分析结果表明:HPLC-RID法是一种准确、快速测定甘油二酯含量的方法,磷脂酶a1催化水解通过分子蒸馏后得到产品中甘油二酯含量为42.64%。通过GC测定了原料大豆油和分子蒸馏轻相的脂肪酸组成和含量,分析结果表明:和原料大豆油相比,分子蒸馏得到的轻相脂肪酸中棕榈酸含量显著提高,而不饱和脂肪酸含量减少。经大豆油制备的甘油二酯产品,不饱和脂肪酸双键含量较多,容易受到周围环境因素的影响而被氧化。试验中以TBHQ和抗坏血酸棕榈酸酯为抗氧化剂,使用Rancimat法,在空气流量为10L/h、温度为110℃时,研究了50ppm,100ppm,150ppm和200ppm等不同剂量的抗氧化剂的条件下甘油二酯产品的诱导时间。结果表明:抗氧化剂TBHQ的最适浓度为100ppm,甘油二酯产品的诱导时间为9.62h。

关键词：磷脂酶a1 大豆油甘油二酯分子蒸馏抗氧化性

杨梅叶原飞燕草素对胰脂肪酶和磷脂酶a1的影响

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食品科学 2018年第11期39卷 165-170页

作者：周晓舟陈士国叶兴乾浙江大学生物系统工程与食品科学学院浙江杭州310058

比较了奥利司他(Orlistat)以及不同加工程度的杨梅叶原飞燕草素提取物(杨梅叶粉末、杨梅叶含糖提取物和杨梅叶去糖提取物)对胰脂肪酶和磷脂酶a1在体外以及SD大鼠小肠内的活性抑制能力。结果表明:Orlistat对体外和大鼠小肠内的胰脂肪酶... 详细信息

比较了奥利司他(Orlistat)以及不同加工程度的杨梅叶原飞燕草素提取物(杨梅叶粉末、杨梅叶含糖提取物和杨梅叶去糖提取物)对胰脂肪酶和磷脂酶a1在体外以及SD大鼠小肠内的活性抑制能力。结果表明:Orlistat对体外和大鼠小肠内的胰脂肪酶的活性抑制率均为最高,分别为99.0%和96.5%,排在第二的去糖提取物分别为90.9%和91.4%;Orlistat对体外和大鼠小肠内的磷脂酶a1的活性抑制率也均为最高,分别为97.1%和97.2%,排在第二的去糖提取物分别为96.7%和87.7%。检测了去糖提取物的半抑制浓度,对于胰脂肪酶和磷脂酶a1分别为0.01 mg/m L和0.06 mg/m L,分析其对胰脂肪酶的抑制类别为竞争性抑制+反竞争性抑制,对磷脂酶a1的抑制类别为竞争性抑制,杨梅叶原飞草素是一种潜在的高效、可控的新型减肥产品。

关键词：杨梅叶原飞燕草素胰脂肪酶磷脂酶a1 减肥