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质粒介导的短发卡状RNA特异性抑制大肠癌cerb-B1基因的表达

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南京医科大学学报（自然科学版） 2007年第2期27卷 137-141,F0003页

作者：吴相柏邬跃刚宋文军曹政吴利达陶凯雄宜昌市第二人民医院外科湖北宜昌443000 华中科技大学同济医学院附属协和医院普通外科湖北武汉430022

目的:体外构建编码人类基因cerb-B1短发卡状RNA(shorthairpinrna,shrna)的质粒表达载体,观察其对结肠癌LoVo细胞cerb-B1基因和表皮生长因子受体(EGFR)蛋白的特异性抑制作用。方法:体外合成cerb-B1基因的DNA模板引物,和Pgenesil-1质粒构... 详细信息

目的:体外构建编码人类基因cerb-B1短发卡状RNA(shorthairpinrna,shrna)的质粒表达载体,观察其对结肠癌LoVo细胞cerb-B1基因和表皮生长因子受体(EGFR)蛋白的特异性抑制作用。方法:体外合成cerb-B1基因的DNA模板引物,和Pgenesil-1质粒构建编码shrna的表达载体。应用脂质体Lipofectamine2000转染人结肠癌LoVo细胞,转染成功后以G418筛选4周,实时荧光定量RT-PCR(RealTimeRT-PCR)检测cerb-B1基因的mrna表达,Western-blot检测EGFR蛋白的表达。结果:质粒载体经酶切鉴定证实DNA模板插入质粒成功,且测序与设计结果相符,成功的构建了针对原癌基因cerb-B1的质粒表达载体。质粒载体成功转染后,cerb-B1基因mrna表达下降了(81.3±2.8)%,EGFR蛋白表达下降了(73.4±2.3)%,和对照质粒载体组比较有显著性差异。结论:说明本研究构建的针对cerb-B1基因的质粒表达载体可以显著抑制cerb-B1基因和EGFR蛋白在人结肠癌LoVo细胞的表达,为结肠癌的基因治疗提供了新的思路。

关键词：短发卡状RNA rna干扰 cerb—B1基因表皮生长因子受体结肠癌

三位点短发卡状RNA在提高rna干扰效率中的作用

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中国癌症杂志 2008年第4期18卷 249-253页

作者：翁艳洁翁丹卉夏曦宋晓红卢运萍王世宣马丁王常玉华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科湖北武汉430030

背景与目的:shrna技术是近来发展的热点技术之一,但普遍采用的单位点shrna干扰载体效果并不理想。本研究探讨三位点短发卡状RNA在提高rna干扰效率中的作用。方法:构建外源基因DsRed全长载体转染HEK293细胞。针对报告基因DsRed设计4个干... 详细信息

背景与目的:shrna技术是近来发展的热点技术之一,但普遍采用的单位点shrna干扰载体效果并不理想。本研究探讨三位点短发卡状RNA在提高rna干扰效率中的作用。方法:构建外源基因DsRed全长载体转染HEK293细胞。针对报告基因DsRed设计4个干扰载体,一个含有3段shrna,另外3个分别含有此3段中1段shrna。转染293/DsRed,荧光显微镜观察基因DsRed。应用实时定量PCR(Real-timePCR)和流式细胞仪(FACS)检测4个载体对DsRed基因在mrna及蛋白水平干扰效应。结果:4个载体对靶基因DsRed在mrna及蛋白水平均有干扰效应,且含有3段shrna载体对DsRed基因干扰效率为(89±16)%,显著高于3个只含有1段shrna载体[(50±23)%,(52±15)%,(55±27)%],差异有显著性(Prna干扰载体可以提高对靶基因的干扰效率。

关键词： rna干扰外源基因 DsRed 短发卡状RNA

短发卡状RNA特异性抑制表皮生长因子受体对大肠癌细胞凋亡的影响

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临床外科杂志 2007年第6期15卷 407-409页

作者：顾昱吴相柏李拥军尹宜发李欣邹立勇湖北省宜昌市第二人民医院肿瘤科 443000 湖北省宜昌市第二人民医院普通外科 443000

目的体外构建编码人类表皮生长因子受体(EGFR)的短发卡状RNA(shrna)的质粒表达载体,观察其对结肠癌LoVo细胞EGFR的特异性抑制作用以及对细胞凋亡的影响。方法体外合成EGFR的DNA模板引物和Pgenesil-1质粒构建编码shrna的表达载体。应用... 详细信息

目的体外构建编码人类表皮生长因子受体(EGFR)的短发卡状RNA(shrna)的质粒表达载体,观察其对结肠癌LoVo细胞EGFR的特异性抑制作用以及对细胞凋亡的影响。方法体外合成EGFR的DNA模板引物和Pgenesil-1质粒构建编码shrna的表达载体。应用脂质体Lipofectamine2000转染人结肠癌LoVo细胞,转染成功后以G418筛选4周,实时荧光定量RT-PCR(realtime RT-PCR)和Western-blot检测EGFR的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果成功的构建了针对EGFR的质粒表达载体。质粒载体成功转染后,EGFR mrna表达下降了(81.3±2.8)%,蛋白表达下降了(73.4±2.3)%,细胞凋亡增加了(10.1±0.4)%,和对照质粒载体比较差异有统计学意义。结论我们构建的针对EGFR的质粒表达载体可以显著抑制其在人结肠癌LoVo细胞的表达,诱导细胞凋亡,为结肠癌的基因治疗提供了新的思路。

关键词：短发卡状RNA rna干扰表皮生长因子受体结肠癌

shrna介导GSTP1基因沉默对激素非依赖性前列腺癌细胞株DU145的影响

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中南大学学报（医学版） 2012年第8期37卷 807-816页

作者：金鹏谢晋良朱向荣周成丁翔杨罗艳中南大学湘雅医院器官移植中心长沙410008 中南大学湘雅二医院泌尿外科长沙410011

目的:探讨谷胱甘肽巯基转移酶P1(glutathione S-transferase P1,GSTP1)基因沉默对雄激素非依赖性前列腺癌细胞株DU145增殖活性和对化学治疗药物敏感性的影响。方法:根据选取靶序列形成短发卡状RNA(short hairpinrna,shrna)的DNA模板设计... 详细信息

目的:探讨谷胱甘肽巯基转移酶P1(glutathione S-transferase P1,GSTP1)基因沉默对雄激素非依赖性前列腺癌细胞株DU145增殖活性和对化学治疗药物敏感性的影响。方法:根据选取靶序列形成短发卡状RNA(short hairpinrna,shrna)的DNA模板设计3条表达载体(shrna255,shrna554,shrna593),并克隆到质粒pGPU6/GFP/Neo。经酶切和测序鉴定,筛选转染率最高基因沉默效果最好的shrna作rna干扰。DU145细胞株分为空白质粒转染组和shrna转染组。转染前后按化学治疗药物分为氟尿嘧啶(fluorouracil,FU)组及紫杉醇(paclitaxel,PA)组,并按作用浓度(FU:30,60,120,240μg/mL;PA:0.2,2,10,20μg/mL)分别分成4个亚组,并分别设有一个空白对照组。四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]比色法检测转染后细胞增殖活性的变化,MTT及末端脱氧核苷酸转移酶介导脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记法(terminal de-oxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检测转染前后不同浓度FU和PA对DU145细胞抑制增殖及诱导凋亡的效果。结果:3条表达载体(pGPU6/GFP/Neo-shrna255,pGPU6/GFP/Neo-shrna554,pGPU6/GFP/Neo-shrna593)的转染率分别为(63.3±1.04)%,(76.2±0.68)%,(72.7±0.33)%,shrna554转染率最高,三者之间比较差异有统计学意义(Prna含量分别为128.31±2.50,43.24±4.30和85.62±6.30,GSTP1蛋白含量分别为163.92±12.40,65.38±9.30和114.25±16.70,shrna554转染后GSTP1基因mrna和蛋白含量均最低,三者比较差异有统计学意义(Prna介导的GSTP1基因沉默可抑制雄激素非依赖型前列腺癌DUl45细胞增殖活性,诱导凋亡,并且其作用呈现时间依赖性,可提高其对于化学治疗的药物敏感性。

关键词：前列腺癌细胞株DU145 短发卡状RNA 谷胱甘肽S-转移酶P1 化学治疗敏感性

趋化性细胞因子受体CXCR4基因沉默对乳腺癌细胞体外侵袭和定向肺转移的影响

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中华肿瘤杂志 2008年第5期30卷 325-329页

作者：张孟贤韩娜于世英冷彦华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤中心武汉430030

目的利用rna干扰技术下调趋化性细胞因子受体CXCR4基因的表达，探讨其沉默对乳腺癌细胞体外侵袭及肺转移潜能的影响。方法设计合成CXCR4的特异性短发卡状RNA（shrna），将其插入至pSilencer载体中，并将重组后的pSilencer质粒载体经脂... 详细信息

目的利用rna干扰技术下调趋化性细胞因子受体CXCR4基因的表达，探讨其沉默对乳腺癌细胞体外侵袭及肺转移潜能的影响。方法设计合成CXCR4的特异性短发卡状RNA（shrna），将其插入至pSilencer载体中，并将重组后的pSilencer质粒载体经脂质体包裹转染乳腺癌MDA—MB-231细胞株，抗性筛选稳定抑制CXCR4表达的永久细胞克隆。应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和Western blot法，检测shrna对细胞内CXCR4基因表达的影响。利用Boyden小室模型检测细胞体外侵袭能力。二苯基溴化四氮唑蓝（M1TF）法检测细胞的增殖状况。通过裸鼠尾静脉瘤细胞注射方法，构建肺转移模型，检测CXCR4基因沉默对乳腺癌细胞肺转移能力的影响。结果成功构建和筛选出CXCR4特异性的shrna质粒载体，稳定转染CXCR4-shrna的乳腺癌细胞的CXCR4mrna和蛋白的表达较空白对照组明显下调（29．5％±3．8％比69．7％±2．6％．15．4％±1．1％比39．0％±2．4％；均P〈0．01），体外侵袭能力减弱，增殖速度减慢，肺转移能力下降。结论以CXCR4为靶向的shrna能够有效下调CXCR4基因的表达，降低人乳腺癌细胞体外侵袭、增殖以及肺转移的能力。CXCR4是乳腺癌侵袭和转移过程中的重要调控因子。

关键词： CXCR4基因短发卡状RNA 乳腺肿瘤肿瘤转移

基质细胞衍生因子-1及其受体CXCR4对膀胱癌细胞侵袭能力及腔内种植的影响

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医学研究生学报 2014年第10期27卷 1028-1032页

作者：杨德林霍倩王乙水杨旭升王凯王剑松徐鸿毅王海峰昆明医科大学第二附属医院泌尿外科(云南省泌尿外科研究所) 昆明医学博士650101

目的复发和转移是膀胱癌治疗失败的主要原因。文中利用rna干扰技术使趋化性细胞因子受体CXCR4基因沉默,探讨其沉默对膀胱癌细胞侵袭能力及腔内种植的影响。方法设计合成CXCR4的特异性短发卡状RNA(short hairpin,shrna),筛选出能够稳定抑... 详细信息

目的复发和转移是膀胱癌治疗失败的主要原因。文中利用rna干扰技术使趋化性细胞因子受体CXCR4基因沉默,探讨其沉默对膀胱癌细胞侵袭能力及腔内种植的影响。方法设计合成CXCR4的特异性短发卡状RNA(short hairpin,shrna),筛选出能够稳定抑制CXCR4表达的细胞,并分为空白对照组、阴性对照质粒组、pshrna-CXCR4-1实验组,pshrna-CXCR4-2实验组,应用RT-PCR和免疫荧光分别检测CXCR4 mrna和蛋白表达水平,应用Boyden小室模型检测体外侵袭能力的变化。将20只裸小鼠随机数表法分为实验裸小鼠和对照裸小鼠,各10只。向实验裸小鼠膀胱内注入100μL Shrna-EJ-M3,向对照裸小鼠膀胱内注入100μL EJ-M3细胞,检测shrna-CXCR4对膀胱癌细胞腔内种植能力的影响。结果稳定转染后的pshrna-CXCR4-1实验组CXCR4 mrna表达(62.05±1.35)较空白对照组(174.38±1.96)和阴性对照组(166.27±1.82)明显下降(Prna-CXCR4-2实验组CXCR4 mrna表达水平(182.58±4.2)与空白对照组和阴性对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);免疫荧光实验中pshrna-CXCR4-1实验组红色免疫荧光细胞数(32.24±2.23)较空白对照组(89.61±4.47)和阴性对照组(92.45±3.68)降低(Prna-CXCR4-2实验组红色免疫荧光细胞数(76.87±5.11)与空白对照组和阴性对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。体外趋化侵袭实验结果显示,pshrnaCXCR4-1实验组穿膜细胞数(39.67±8.45)明显少于空白对照组(135.33±9.28)及阴性对照组(123.63±6.36),差异有统计学意义(Prna能有效抑制膀胱癌细胞基因CXCR4的表达,显著降低膀胱癌细胞体外侵袭能力及腔内种植能力,SDF-1/CXCR4生物轴有望成为预防和治疗膀胱癌侵袭和转移的重要靶点之一。

关键词： CXCR4基因短发卡状RNA 膀胱癌侵袭

靶向XT-1基因shrna真核表达质粒载体的构建及筛选

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山东医药 2009年第3期49卷 19-21页

作者：余资江余德立贵阳医学院贵州贵阳550004 贵阳中医学院第二附属医院

目的构建靶向木糖转移酶-1(XT-1)的短发卡状小干扰rna(shrna)质粒表达载体;为寻找脊髓损伤治疗的新靶点提供工具。方法设计4个小分子短发卡状RNA(sirna)序列,体外合成DNA模板引物,与Pgenesil-1质粒构建成编码shrnaR的表达载体,进行酶切... 详细信息

目的构建靶向木糖转移酶-1(XT-1)的短发卡状小干扰rna(shrna)质粒表达载体;为寻找脊髓损伤治疗的新靶点提供工具。方法设计4个小分子短发卡状RNA(sirna)序列,体外合成DNA模板引物,与Pgenesil-1质粒构建成编码shrnaR的表达载体,进行酶切和测序,再转染体外培养的星形胶质细胞,筛选靶序列。结果构建的质粒表达载体完全符合设计要求,转染成功的细胞在荧光显微镜下显示绿色荧光,G418可以筛选出阳性克隆。结论成功构建了编码XT-1-shrna的质粒表达载体;该载体为寻找脊髓损伤治疗的新靶点奠定了基础。

关键词：硫酸软骨素蛋白多糖木糖转移酶-1 小分子干扰rna 短发卡状RNA 质粒载体

重组结缔组织生长因子shrna质粒的构建及其对肝星状细胞基因表达的影响

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中国中西医结合消化杂志 2016年第10期24卷 733-736,740页

作者：余琴王乾华赵磊毕昊武汉血液中心检验科湖北武汉430000 华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科湖北武汉430022

[目的]构建同时干扰大鼠结缔组织生长因子(CTGF)2个不同基因位点的shrna质粒,并将其转染肝星状细胞(HSC),研究其对CTGF基因表达的影响。[方法]针对大鼠CTGF mrna靶向序列设计并合成2对DNA模版序列,用PCR的方法将2条CTGF靶向特异性的shRN... 详细信息

[目的]构建同时干扰大鼠结缔组织生长因子(CTGF)2个不同基因位点的shrna质粒,并将其转染肝星状细胞(HSC),研究其对CTGF基因表达的影响。[方法]针对大鼠CTGF mrna靶向序列设计并合成2对DNA模版序列,用PCR的方法将2条CTGF靶向特异性的shrna分别链接到质粒pGenesil1.2载体的U6启动子和H1启动子。将构建的干扰质粒以阳离子脂质体法转染HSC-T6细胞,应用RT-PCR及Western Blot检测CTGF的表达。[结果]成功构建CTGF shrna重组质粒;通过RT-PCR和Western Blot分析发现干扰质粒组的CTGF mrna与蛋白表达水平明显下降(Prna能有效抑制HSC中CTGF的表达。

关键词：短发卡状RNA 结缔组织生长因子质粒肝纤维化

rna干扰沉默HDAC1基因对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响

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世界华人消化杂志 2008年第11期16卷 1173-1178页

作者：张孟贤韩娜于世英华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤科湖北省武汉市430030

目的:研究下调HDAC1的表达对大肠癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响.方法:设计合成HDAC1的特异性shrna,将其插入至pSilencer载体中,并将重组后的pSilencer质粒载体经脂质体包裹转染SW480细胞株.用RT-PCR和Westernblot检测shrna对细胞内H... 详细信息

目的:研究下调HDAC1的表达对大肠癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响.方法:设计合成HDAC1的特异性shrna,将其插入至pSilencer载体中,并将重组后的pSilencer质粒载体经脂质体包裹转染SW480细胞株.用RT-PCR和Westernblot检测shrna对细胞内HDAC1基因表达的影响,同时采用Westernblot对细胞周期相关基因进行检测.采用MTT法检测生长抑制作用.运用流式细胞术检测细胞的凋亡情况和细胞周期分布.结果:成功构建和筛选出HDAC1特异性的shrna质粒载体,与空白对照组相比,转染HDAC1-shrna的大肠癌细胞HDAC1mrna蛋白质表达水平明显下降(30.4%±4.5%vs64.6%±4.4%,Prna能够有效下调HDAC1基因,诱导大肠癌细胞发生凋亡和细胞周期阻滞,从而抑制细胞的增殖.

关键词： HDAC1基因短发卡状RNA 大肠癌凋亡增殖逆转录聚合酶链反应