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柽柳再生和转化体系的建立及瞬时转化TcSYP121基因功能分析

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南方农业学报 2024年第3期55卷 823-833页

作者：韩帅靳芊芊殷楠张国君徐兴兴河北科技师范学院园艺科技学院/河北省特色园艺种质挖掘与创新利用重点实验室/河北省高校特色园艺植物生物育种应用技术研发中心河北秦皇岛066600

【目的】建立柽柳再生及遗传转化体系并分析瞬时转化柳树突触融合蛋白(TcSYP121)基因功能,为筛选柽柳分子抗性育种候选基因及盐碱土的改良和生态修复提供理论参考。【方法】通过单因素筛选最佳外植体、消毒处理、各阶段(初代、分化、增... 详细信息

【目的】建立柽柳再生及遗传转化体系并分析瞬时转化柳树突触融合蛋白(TcSYP121)基因功能,为筛选柽柳分子抗性育种候选基因及盐碱土的改良和生态修复提供理论参考。【方法】通过单因素筛选最佳外植体、消毒处理、各阶段(初代、分化、增殖和生根)的培养基类型及激素浓度建立柽柳再生体系;通过正交试验分析影响转化体系的4个因素(预培养时间、侵染时间、共培养时间和农杆菌浓度);通过PCR扩增及电泳结果验证柽柳转化体系;瞬时转化TcSYP121基因获得过表达植株(OE)和病毒诱导的基因沉默植株(VI),进行表型观测、植物超氧阴离子染色液(NBT)和二氨基联苯胺法(DAB)染色并测定盐腺直径和盐腺密度、叶绿素含量、超氧化物酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性及TcSYP121基因相对表达量,分析TcSYP121基因的功能。【结果】最优外植体为柽柳嫩茎段,最适宜次氯酸钠(NaClO)消毒浓度为5%,最佳消毒时间为5 min,最适合的初代培养基为MS培养基,最佳分化培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA,最佳增殖培养基为MS+1.5mg/L6-BA+0.1mg/LIBA,最佳生根培养基是1/2MS+0.5mg/L IBA。转化体系中正交试验结果为最佳预培养时间是2 d,最佳侵染时间是5 min,最佳共培养时间是2 d,最佳农杆菌浓度OD600为0.8,抗生素头孢霉素(Cef)浓度为300 mg/L,卡那霉素(Kan)筛选压为30 mg/L。PCR扩增及电泳结果显示,利用该遗传转化体系可获得阳性转基因植株。瞬时转化TcSYP121基因柽柳的耐盐功能分析结果显示,在盐胁迫下,VI和对照(CK)柽柳中叶绿素含量显著下降(P0.05);OE柽柳SOD和POD活性均高于VI与CK,且OE中Tc SYP121基因的相对表达量高于CK和VI。【结论】建立了柽柳的再生体系和遗传转化体系,通过对柽柳进行瞬时转化获得过表达和沉默表达柽柳,证实TcSYP121基因能够提高柽柳耐盐性。

关键词：柽柳转化体系再生体系 TcSYP121基因瞬时转化耐盐

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日本落叶松瞬时转化体系的优化及初步应用

林业科学研究 2024年第3期37卷 129-135页

作者：邢俊霞臧巧路叶查龙张陈谊程冬霞齐力旺杨玲李万峰林木遗传育种全国重点实验室东北林业大学黑龙江哈尔滨150040 林木遗传育种全国重点实验室国家林草局林木培育重点实验室中国林业科学研究院林业研究所北京100091 山西农业大学山西太谷030801

[目的]优化农杆菌介导的日本落叶松胚性愈伤组织瞬时转化体系。[方法]以液体增殖培养7 d的日本落叶松胚性愈伤组织为受体材料,利用携带β-葡糖醛酸酶基因(GUS)的pCAMBIA1305.1载体进行瞬时转化,根据GUS的表达量及酶活性,筛选最佳侵染液... 详细信息

[目的]优化农杆菌介导的日本落叶松胚性愈伤组织瞬时转化体系。[方法]以液体增殖培养7 d的日本落叶松胚性愈伤组织为受体材料,利用携带β-葡糖醛酸酶基因(GUS)的pCAMBIA1305.1载体进行瞬时转化,根据GUS的表达量及酶活性,筛选最佳侵染液浓度、侵染时间和共培养时间。并利用筛选出的转化体系,分析落叶松scarecrow-like 6(LaSCL6)启动子的活性。[结果]瞬时转化后,GUS表达明显。当侵染液浓度OD600为0.2,侵染5 min,共培养72 h时,GUS的表达量最高,△CT值为-2.274 2;当侵染液浓度OD600为0.05,侵染5 min,共培养72 h时,GUS酶活性最高,为25.728 6 U·L^(-1)。LaSCL6启动子的活性是CaMV35S启动子的1.55倍。[结论]综合考虑GUS的表达量和酶活性,当侵染液浓度OD600为0.05,侵染5 min,共培养24 h时,GUS的表达量和酶活性较高,这一条件可以用来进行日本落叶松胚性愈伤组织的高效转化。

关键词：落叶松瞬时转化胚性愈伤组织 GUS 启动子

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珠芽魔芋原生质体制备体系优化及瞬时转化

分子植物育种 2024年

作者：汪子扬李云芳赵星张杰徐慧妮李昆志昆明理工大学生命科学与技术学院

为探明不同因素对珠芽魔芋叶肉原生质体分离、酶解过程的影响，建立瞬时转化体系，本研究以珠芽魔芋幼苗为材料，进行了酶用量、叶片用量、酶解时间、酶解温度等在不同水平条件下对原生质体分离影响的研究。结果表明，纤维素酶和离析酶... 详细信息

为探明不同因素对珠芽魔芋叶肉原生质体分离、酶解过程的影响，建立瞬时转化体系，本研究以珠芽魔芋幼苗为材料，进行了酶用量、叶片用量、酶解时间、酶解温度等在不同水平条件下对原生质体分离影响的研究。结果表明，纤维素酶和离析酶分别在2.0%:0.1%、叶片0.1 g/mL、温度为30 ℃的暗环境中酶解6 h时，酶解效率最高；应用PEG法成功将绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pri101-GFP瞬时转化到珠芽魔芋原生质体中，且在受体中获得表达。珠芽魔芋悬浮细胞原生质体的最佳制备条件及瞬时转化体系的研究，后续可以研究珠芽魔芋抗软腐病等转基因植物，提高魔芋抗病能力，增加葡甘聚糖产量。

关键词：珠芽魔芋原生质体分离纯化瞬时转化

油棕体胚发生相关基因EgWOX5的转化与瞬时表达

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分子植物育种 2024年

作者：魏雪珂张大鹏聂浩石鹏 Yin Min Htwe 李志瑛于群王永中国热带农业科学院椰子研究所热带作物生物育种全国重点实验室中国热带农业科学院三亚研究院华中农业大学园艺林学学院

遗传转化和基因编辑是生物育种技术发展的趋势，但油棕尚未建立高效遗传转化体系。前期研究发现油棕EgWOX5在体胚阶段上调表达，可能在体胚发生过程中发挥重要作用。本研究分别通过农杆菌和PEG介导法转化油棕愈伤和原生质体，建立油棕... 详细信息

遗传转化和基因编辑是生物育种技术发展的趋势，但油棕尚未建立高效遗传转化体系。前期研究发现油棕EgWOX5在体胚阶段上调表达，可能在体胚发生过程中发挥重要作用。本研究分别通过农杆菌和PEG介导法转化油棕愈伤和原生质体，建立油棕转化体系并研究EgWOX5的亚细胞定位。结果表明：构建的EgWOX5过表达及N端、C端融合GFP的载体，转化愈伤后均可观察到绿色荧光信号，验证了该转化体系在油棕愈伤中的可行性；分别从愈伤和叶片中分离出了高质量的原生质体，其中叶片酶解时间(6 h)与愈伤(4 h)相比较长，且存在叶绿体等细胞器干扰；愈伤及叶片原生质体中的亚细胞定位结果均表明，EgWOX5定位于细胞核中，验证了该瞬时转化体系在油棕原生质体中的可行性。本研究为建立优化油棕高效遗传转化体系提供了参考，同时也为油棕基因的亚细胞定位研究提供了技术支撑。

关键词：油棕 EgWOX5 瞬时转化愈伤原生质体

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植物原生质体分离及其瞬时转化的应用

热带生物学报 2024年第2期15卷 241-250页

作者：马超越彭世清郭冬朱家红王颖河北农业大学林学院河北保定071000 中国热带农业科学院热带生物技术研究所海口571101

原生质体已被广泛应用于亚细胞定位、基因表达分析、蛋白-蛋白互作、基因编辑等方面。笔者总结了酶解法分离植物原生质体的影响因素,电穿孔和PEG介导的方法对原生质体瞬时转化效率的影响和瞬时转化的应用。植物的种类、不同的PEG浓度、... 详细信息

原生质体已被广泛应用于亚细胞定位、基因表达分析、蛋白-蛋白互作、基因编辑等方面。笔者总结了酶解法分离植物原生质体的影响因素,电穿孔和PEG介导的方法对原生质体瞬时转化效率的影响和瞬时转化的应用。植物的种类、不同的PEG浓度、转染时间、DNA浓度和原生质体数量都会影响PEG介导法对原生质体瞬时转化效率。电穿孔法必须在脉冲电压、脉冲长度、脉冲数、细胞数、DNA浓度都适宜的条件下才能达到最佳转化效率。本文为更多植物原生质体分离体系和瞬时转化体系的建立提供参考。

关键词：原生质体酶解法瞬时转化

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桃愈伤组织和果实瞬时转化体系的优化

北京农学院学报 2024年第1期39卷 13-17,57页

作者：杨海清吴凡颖王睿琦常明明肖婷婷刘悦萍北京市平谷区果品产业服务中心北京101200 北京农学院生物与资源环境学院/农业农村部华北都市农业重点实验室北京农学院植物科学技术学院北京102206

【目的】为建立和优化桃愈伤组织和果实瞬时转化体系。【方法】筛选桃愈伤组织诱导的最佳外植体及培养条件,优化桃愈伤组织和离体果实进行农杆菌瞬时转化的体系。【结果】采用叶片、茎段和种胚为外植体均诱导出愈伤组织,叶片最高诱导率... 详细信息

【目的】为建立和优化桃愈伤组织和果实瞬时转化体系。【方法】筛选桃愈伤组织诱导的最佳外植体及培养条件,优化桃愈伤组织和离体果实进行农杆菌瞬时转化的体系。【结果】采用叶片、茎段和种胚为外植体均诱导出愈伤组织,叶片最高诱导率为85.8%,用种胚诱导愈伤可达到95.8%的诱导率,且形成的愈伤组织更松散。后续的继代培养中使用4 g/L PVP处理可以缓解愈伤组织的褐化。桃愈伤组织采用浸染液法,果块采用真空和注射法均可成功转化,不同转化方法共培养3 d为荧光检测的最佳条件。【结论】优化了桃愈伤组织的诱导条件,建立了较为稳定的桃瞬时转化体系,为桃基因的快速验证奠定了技术基础。

关键词：桃愈伤组织诱导瞬时转化

‘红满堂’苹果MbbZIP43基因的克隆与功能研究

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生物技术通报 2024年第2期40卷 146-159页

作者：杨艳胡洋刘霓如殷璐杨锐王鹏飞穆霄鹏张帅程春振张建成山西农业大学园艺学院太谷030801

【目的】为探究碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子在‘红满堂’苹果花青素代谢中的调控作用。【方法】从‘红满堂’苹果克隆得到一个bZIP基因,分析了其基因及编码蛋白序列特性,利用洋葱表皮细胞瞬时转化确定其编码蛋白亚细胞定位,利用实时... 详细信息

【目的】为探究碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子在‘红满堂’苹果花青素代谢中的调控作用。【方法】从‘红满堂’苹果克隆得到一个bZIP基因,分析了其基因及编码蛋白序列特性,利用洋葱表皮细胞瞬时转化确定其编码蛋白亚细胞定位,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)研究了该基因在不同成熟时期‘红满堂’果实中的表达情况,基于烟草叶片、苹果叶片以及苹果果实瞬时转化研究了其对花青素积累和花青素合成相关结构基因表达的调控作用。【结果】该基因不含内含子,与MdbZIP43(XP_008393381.1)相似度最高,故命名为MbbZIP43。其编码序列长为522 bp,可编码由173 aa组成、含有bZIP_plant_GBF1结构域、定位于细胞核的亲水蛋白。RT-qPCR分析结果显示,随着果实成熟,MbbZIP43在‘红满堂’果实中的表达水平呈“先升后降”的变化趋势,在花后11周的果实中表达量最高。相关性分析显示MbbZIP43基因表达量与总黄酮和花青素含量正相关。瞬时过表达该基因的烟草叶片、苹果叶片和果皮中花青素含量分别提高了17.42%、25.66%和48.99%,过表达MbbZIP43的苹果叶片中花青素合成结构基因CHI、F3'H、DFR和UFGT分别提高了2.27倍、1.84倍、2.39倍和2.89倍;过表达MbbZIP43的苹果果皮中CHI、F3'H、DFR和UFGT分别提高了1.79倍、1.70倍、1.35倍和1.51倍,说明MbbZIP43可以通过上调这些结构基因的表达正调控苹果花青素合成。【结论】MbbZIP43可通过激活花青素合成相关结构基因CHI和UFGT等的表达进而促进花青素的积累。

关键词： bZIP转录因子苹果花青素合成调控基因克隆瞬时转化表达分析亚细胞定位

梨叶片原生质体制备方法的建立及其基因瞬时转化试验

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园艺学报 2023年第5期50卷 1141-1150页

作者：高成昱王艺衡靳江周李涛李金斗周梦瑶张海霞马辉张玉星亓宝秀许建锋河北农业大学园艺学院河北保定071051 河北省梨技术创新中心河北保定071051 英国利物浦约翰摩尔大学药学和分子生物学学院英国利物浦L33AF

以‘新梨7号’梨叶片为材料,探究影响原生质体分离的主要因素,制备高产优质的叶肉原生质体,并进行基因瞬时转化和表达。将继代30 d的组培苗嫩叶在最佳酶解液(1.0%纤维素酶,0.1%果胶酶,0.4%离析酶,0.5 mol·L^(-1)甘露醇,20 mmol·L^(-1)... 详细信息

以‘新梨7号’梨叶片为材料,探究影响原生质体分离的主要因素,制备高产优质的叶肉原生质体,并进行基因瞬时转化和表达。将继代30 d的组培苗嫩叶在最佳酶解液(1.0%纤维素酶,0.1%果胶酶,0.4%离析酶,0.5 mol·L^(-1)甘露醇,20 mmol·L^(-1)KCl,20 mmol·L^(-1)MES,10 mmol·L^(-1)CaCl_(2),1.0 g·L^(-1)BSA)中酶解12 h,可制备出产量为1.09×10^(6)protopl·mL^(-1)、活力为90%的原生质体。将1~2μg·mL^(-1)pROK2-GFP质粒DNA通过40%PEG-4000介导转化至上述原生质体中并培养12 h,可以观察到GFP绿色荧光信号,转化率可达40%。

关键词：梨叶片原生质体制备瞬时转化

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菊花花瓣原生质体分离与瞬时转化体系的建立

植物生理学报 2023年第10期59卷 1951-1963页

作者：李志美张碧佩伍青吕金赵鑫潘燕郭炜珊周厚高王凤兰罗红辉仲恺农业工程学院/广东省普通高校热带亚热带花卉与园林植物重点实验室广州510225

本研究以3个菊花(Chrysanthemum morifolium)品种‘帝王水晶’(‘Chrystal Regal’)、‘紫红托桂’(‘Zihong Tuogui’)和‘紫风车’(‘Zi Fengche’)为实验材料,通过轻摇酶解法及酶解前真空处理制备优质的菊花原生质体,并初步以改良的... 详细信息

本研究以3个菊花(Chrysanthemum morifolium)品种‘帝王水晶’(‘Chrystal Regal’)、‘紫红托桂’(‘Zihong Tuogui’)和‘紫风车’(‘Zi Fengche’)为实验材料,通过轻摇酶解法及酶解前真空处理制备优质的菊花原生质体,并初步以改良的聚乙二醇4000(PEG 4000)介导转化结合热激处理技术建立了菊花花瓣原生质体瞬时转化体系。结果表明,在菊花花瓣组织中可获得完整并有活力的原生质体数量比叶片中多;其中,采用含10 g·L^(-1)纤维素酶、6 g·L^(-1)离析酶、2 g·L^(-1)崩溃酶和400 mmol·L^(-1)甘露醇的酶解液体系,酶解前抽真空处理20~25 min,并置于摇床中22℃、30 r·min^(-1)轻摇酶解12~14 h,‘帝王水晶’和‘紫风车’花瓣原生质体产量分别可达2.8×10^(5)和7.0×10^(5)个·g^(-1)(FW),活力分别为63.9%和76.9%,能满足瞬时表达实验要求。用等体积的含100 mmol·L^(-1)CaCl_(2)、400 mmol·L^(-1)甘露醇和300 g·L^(-1)PEG 4000的缓冲液体系分别介导3个菊花品种的花瓣原生质体(200μL,2×10^(5)个·mL^(-1))转化,并于28℃热激处理60 s,35S启动的外源基因(OsVPE1-GFP)在花瓣原生质体中瞬时表达的绿色荧光信号较强,瞬时转化效率为30%以上。

关键词：菊花花瓣叶片原生质体分离瞬时转化