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瞬时基因表达可溶性的VEGFR2：I-IV

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生物工程学报 2008年第5期24卷 810-816页

作者：李军易小萍张元兴孙祥明华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237

通过RT-PCR的方法从三个月的流产绒毛组织中克隆目的基因VEGFR2(Vascular endothelial growth factor receptor 2,血管内皮细胞生长因子受体2)胞外I-IV区,连接到真核表达载体上构建了重组表达载体。首先在无血清悬浮培养的HEK293细胞中... 详细信息

通过RT-PCR的方法从三个月的流产绒毛组织中克隆目的基因VEGFR2(Vascular endothelial growth factor receptor 2,血管内皮细胞生长因子受体2)胞外I-IV区,连接到真核表达载体上构建了重组表达载体。首先在无血清悬浮培养的HEK293细胞中,使用报告基因GFP(Green fluorescence protein,绿色荧光蛋白)优化转染条件,发现在转染时DNA:PEI=1:2(W/W)、1.5μgDNA/106cells及开始转染4h内使用无血清、摇床(120r/min)时可以达到最佳的转染效率和细胞数量。在确定转染条件之后,将构建的表达载体分别在HEK293细胞、COS-7细胞和CHO-K1细胞中进行瞬时转染表达,结果发现仅在CHO-K1细胞的培养上清中检测到目的蛋白的表达。瞬时转染CHO-K1细胞至总体积约为1.5L,由于目的蛋白的羧基端有8-His标签,通过Ni2+-IDA柱纯化得到5mg左右的目的蛋白。

关键词： VEGFR2 瞬时基因表达 HEK293 PEI

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MCF-7细胞瞬时基因表达转染模式的建立

解剖学报 2005年第2期36卷 154-158页

作者：张海江韩世炜桑建利何大澄北京师范大学生命科学学院细胞生物学研究所北京100875

目的　建立一种高效、简便、低毒、价廉的瞬时基因表达细胞转染模式。　方法　选择人乳腺癌细胞系MCF 7,采用Polyethylenimine(PEI)作为转染剂,对细胞密度、载体DNA量、PEI氮与DNA磷的比率(PEI N∶DNA P) 以及PEI DNA混合物与细胞... 详细信息

目的　建立一种高效、简便、低毒、价廉的瞬时基因表达细胞转染模式。　方法　选择人乳腺癌细胞系MCF 7,采用Polyethylenimine(PEI)作为转染剂,对细胞密度、载体DNA量、PEI氮与DNA磷的比率(PEI N∶DNA P) 以及PEI DNA混合物与细胞共存的无血清培养时间等对转染效率的影响进行了比较分析。　结果　转染时的24 孔板每孔接种的细胞以2×105为宜,PEI N∶DNA P的最优比率不是固定的,它与转染时DNA的量有关,每孔转染1 μgDNA时其最优PEI N∶DNA P比率为33∶1左右,而每孔转染4μgDNA时其最优PEI N∶DNA P比率为9∶1左右。另外,PEI DNA混合物与细胞共存的无血清培养时间至少需要3h,最佳时间为5～7h。　结论　利用转染剂PEI, 控制合适的细胞密度、DNA质量、PEI N∶DNA P比率和无血清培养的时间,可成为一种高效、简便、低毒、价廉的瞬时基因表达的细胞转染模式。

关键词：细胞转染瞬时基因表达多聚乙二亚胺

一种农杆菌介导的在烟草叶片中实现外源基因瞬时表达的方法

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新农民 2024年第21期 58-61页

作者：罗昕李云帆浙江大学北京中学

烟草是一种被广泛使用的模式植物，经常被用于分子生物学研究。本研究利用农杆菌介导的转化技术研究了一种新的外源基因在烟草叶片中瞬时表达的系统。首先，通过PCR扩增目的基因，与质粒进行连接后与大肠杆菌转化培养，通过PCR、酶切验... 详细信息

烟草是一种被广泛使用的模式植物，经常被用于分子生物学研究。本研究利用农杆菌介导的转化技术研究了一种新的外源基因在烟草叶片中瞬时表达的系统。首先，通过PCR扩增目的基因，与质粒进行连接后与大肠杆菌转化培养，通过PCR、酶切验证和测序确认基因插入，再转化农杆菌。经侵染后成功在烟草中实现了目的基因（GFP）的表达。本研究有助于推进利用烟草作为模式植物的分子生物学研究，并在各个领域都有应用潜力。

关键词：烟草农杆菌介导转化瞬时基因表达分子生物学研究

葡萄愈伤瞬时转化体系的建立与抗寒候选基因功能研究

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葡萄愈伤瞬时转化体系的建立与抗寒候选基因功能研究

作者：吴洁萍宁夏大学

学位级别：硕士

葡萄(Vitis L.)是世界上重要的经济类果树作物,可酿酒、鲜食、制干、制汁,具有明显的经济、社会与生态效益。2007年葡萄基因组测序的完成,功能基因组学成为葡萄研究工作中的热点,然而高效、简便的转化技术是推动葡萄基因功能研究的重要... 详细信息

葡萄(Vitis L.)是世界上重要的经济类果树作物,可酿酒、鲜食、制干、制汁,具有明显的经济、社会与生态效益。2007年葡萄基因组测序的完成,功能基因组学成为葡萄研究工作中的热点,然而高效、简便的转化技术是推动葡萄基因功能研究的重要因素。瞬时遗传转化是功能研究的重要手段,也是基因功能解析不可或缺的环节。但由于葡萄基因组高度杂合,营养生长期长,再生困难,遗传转化难度大等因素,制约了葡萄功能基因研究。目前,葡萄基因功能的研究通常是以模式植物拟南芥和烟草通过异源表达来进行的。因此,建立一种高效、快速的基因鉴定方法是十分必要的。本研究以‘赤霞珠’小花蕾、叶片、叶柄、茎尖和‘霞多丽’叶片、叶柄、茎尖为试材,研究不同培养基对不同品种和外植体愈伤组织诱导和增殖的影响,以探求最佳的诱导、增殖培养基,并利用愈伤组织对侵染方式、农杆菌菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮(AS)浓度和共培养时间这几种瞬时转化条件进行筛选,建立了一种农杆菌介导的葡萄瞬时转化体系。此外,利用该体系瞬时表达葡萄抗寒基因VaCIPK18,通过检测其在低温的表达水平和鲜重变化验证了瞬时转化体系的可行性,为葡萄一些关键基因的功能研究提供思路和依据。主要研究结果如下:1、优化了葡萄愈伤组织的诱导与增殖培养基。最佳的诱导培养基为B5-Ⅱ:‘赤霞珠’小花蕾、叶片、叶柄、茎尖和‘霞多丽’叶片、叶柄、茎尖在添加0.05 mg·L-1 NAA,0.5 mg·L-1 2,4-D和2.0 mg·L-1 KT的B5培养基(B5-Ⅱ)中愈伤组织诱导率最高,为100%,效果也最好。最佳的增殖培养基为B5-Ⅰ:‘霞多丽’和‘赤霞珠’叶源愈伤组织在添加0.5 mg.L-1 NAA和2.0 mg·L-1 6-BA的B5培养基(B5-Ⅰ)中增殖效果最好,每七天鲜重增加一倍左右。2、建立了农杆菌介导的‘霞多丽’愈伤组织瞬时转化体系。利用根癌农杆菌(EHA105)介导法将含有GUS报告基因的植物表达载体pCAMBIA2301转入愈伤组织,通过GUS组织化学染色法和GUS酶活性分析对转化条件进行筛选。首先筛选常压、真空、超声和超声后真空四种侵染方式,最佳的侵染方式为超声后真空处理;再通过超声后真空处理对瞬时转化体系主要影响因素,如菌液浓度(OD600=0.6、0.8、1.0、1.2)、AS 浓度(0、100、200、300 μM)、侵染时间(3、9、15、21 min)和共培养时间(1、2、3、4 d)进行正交设计,研究结果显示最佳参数是农杆菌菌株EHA105在OD600=0.8下进行4 min超声处理,然后真空5 min并共培养1天,GUS酶活性为352.96±33.95 mol 4-MU/mg/min。此外,发现愈伤组织在75 mg·L-1卡那霉素的抑制作用最大。3、利用VaCIPK18验证农杆菌介导‘霞多丽’愈伤组织瞬时转化体系的可行性。在4℃和-4 ℃处理下,过表达VaCIPK18的‘霞多丽’愈伤组织相对基因表达显著高于未转化的‘霞多丽’愈伤组织,在4℃和-4℃处理10天后,转基因愈伤组织净重显著高于未转化愈伤组织。结果表明瞬时转化VaCIPK18的‘霞多丽’愈伤组织发挥其抗逆功能,验证了农杆菌介导的‘霞多丽’愈伤组织瞬时转化体系可用于研究葡萄抗逆基因的功能。

关键词： ‘霞多丽’愈伤组织农杆菌介导转化瞬时基因表达 GUS染色 VaCIPK18

用于重组蛋白生产HEK293细胞瞬时表达系统的优化

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用于重组蛋白生产HEK293细胞瞬时表达系统的优化

作者：马凯新乡医学院

学位级别：硕士

背景大多数治疗性重组蛋白是在哺乳动物细胞平台中生产的,其中中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞是重要的重组蛋白质生产平台,但其产生的蛋白质有不同于人细胞的翻译后修饰(post-translational modifications,PTMs)。非人源... 详细信息

背景大多数治疗性重组蛋白是在哺乳动物细胞平台中生产的,其中中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞是重要的重组蛋白质生产平台,但其产生的蛋白质有不同于人细胞的翻译后修饰(post-translational modifications,PTMs)。非人源的PTMs会引起人细胞中的免疫原性应答等问题,使用人源化细胞系如人胚胎肾细胞(human embryonic kidney cells,HEK)293则可以有效避免这种风险。HEK293细胞已被用于重组蛋白的瞬时表达,但通常表达水平较低,难以满足应用需求。高效HEK293瞬时表达系统核心技术被国外垄断,因此建立并优化自主产权的HEK293瞬时表达系统具有重要意义。目的建立HEK293高效瞬时表达系统,提高重组蛋白的表达水平。方法1.转染条件和培养工艺优化:构建含有SV40大T抗原、p21CIP+P27cip、P18+a FGF、PDI+bcl-x L、XBP-1S+ERO1-La、P18+IGF-1的共转表达载体,利用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)表达载体筛选出最佳的共转载体;将穿膜肽DLR8、CHR4、CPPMK2与转染试剂以不同方式组合使用,利用EGFP表达载体筛选出最佳的穿膜肽和使用方法;利用EGFP和分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phos-phatase,SEAP)表达载体对转染所用孵育Buffer、转染后换液时间、转染后悬浮时间、悬浮培养基的选择和p DNA最佳浓度等条件进行优化。2.双顺反子载体优化:构建含不同前导(Leader)序列的双顺反子载体,转染HEK293F细胞,利用荧光显微镜、流式细胞术、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immune,ELISA)、蛋白质印迹法(Western blot)、化学发光仪对不同的目的基因进行定量或定性分析,筛选出可以显著增强表达的Leader和载体构建最佳方法。优化双顺反子抗体表达载体并利用上面得到最佳优化方案进行阿达木单抗表达。3.重组蛋白的表达的工艺优化:在最佳转染条件的基础上通过低温培养、小分子添加剂使用、基因递送载体优化等相结合的手段进一步提高SEAP、HSA、IL-6等重组蛋白的表达。结果1.筛选到了最佳的共转载体p STAB-SV40,可提高EGFP表达水平3倍以上(P表达。确定了转染条件的最佳优化方案。2.筛选到两个高效的Leader序列,48 h瞬时表达可以提高双顺反子下游基因表达4～10倍(P表达水平无相关性。在最佳转染条件的基础上使用优化后的阿达木抗体表达载体,蛋白表达水平得到了进一步增强。3.利用HEK293F细胞表达系统成功表达了HSA、IL-6、SEAP等重组蛋白。以IL-6为例,在最佳转染条件的基础上通过共转载体、DLR8增强转染、丁酸钠添加使IL-6的体积产量分别提高了2.26倍、3.58倍、5.26倍(P表达载体,建立了一个高效的HEK293F瞬时表达系统,成功表达了SEAP、IL-6、HSA、阿达木单抗等重组蛋白。

关键词：重组蛋白 HEK293F 共转染工艺优化瞬时基因表达

人源化AGR2单抗在不同宿主细胞中表达的比较

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华南理工大学学报（自然科学版） 2019年第6期47卷 142-148页

作者：谢秋玲汤杰黄嘉慧卢加刘晨雪璇暨南大学生命科学技术学院广东广州510632 基因工程药物国家工程研究中心广东广州510000 韶关学院英东生命科学学院广东韶关512005

Anterior gradient-2(AGR2)基因是一种与肿瘤生长、转移、浸润及耐药性密切相关的基因,以AGR2为靶点的人源化单克隆抗体rhAGR2-mAb有望成为一种新型的抗肿瘤药物.本研究为了进行该抗体的成药性评价,通过瞬时转染的方法分别用HEK293F细胞... 详细信息

Anterior gradient-2(AGR2)基因是一种与肿瘤生长、转移、浸润及耐药性密切相关的基因,以AGR2为靶点的人源化单克隆抗体rhAGR2-mAb有望成为一种新型的抗肿瘤药物.本研究为了进行该抗体的成药性评价,通过瞬时转染的方法分别用HEK293F细胞与CHO细胞这两种最常用的表达系统表达rhAGR2-mAb,获得了纯度为95%的抗体蛋白,同时比较了不同宿主细胞生产的蛋白在分子量、等电点、糖型等方面的差异,发现在分子量、等电点和糖基化的糖型种类方面,两种宿主细胞表达的rhAGR2-mAb并无明显差异,但两者表达的产物在糖型比例上有较大不同,这也导致了两种表达系统所表达的蛋白与抗原AGR2的亲和力略有不同,为rhAGR2-mAb将来选择合适的蛋白瞬时表达系统和稳定生产系统提供依据.

关键词：人源化 AGR2单克隆抗体瞬时基因表达 CHO细胞 HEK细胞

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鼠源抗过敏融合蛋白的瞬时表达及纯化

华东理工大学学报（自然科学版） 2011年第5期37卷 532-537页

作者：程露易小萍孙祥明张元兴华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237 上海富莼科芯生物技术有限公司上海201203

采用流加和降温培养工艺,实现在5 L搅拌式生物反应器规模的瞬时基因表达。首先比较了两种表达载体在CHO-S细胞中的瞬时基因表达,发现pID-mAAFP载体介导的瞬时转染表达可以获得mAAFP的高水平表达。采用pID-mAAFP载体在1.3 L搅拌式生物反... 详细信息

采用流加和降温培养工艺,实现在5 L搅拌式生物反应器规模的瞬时基因表达。首先比较了两种表达载体在CHO-S细胞中的瞬时基因表达,发现pID-mAAFP载体介导的瞬时转染表达可以获得mAAFP的高水平表达。采用pID-mAAFP载体在1.3 L搅拌式生物反应器中进行瞬时基因表达,与分批培养相比,通过流加和降温培养工艺对转染过程进行控制,培养时间延长1倍,蛋白表达浓度提高8倍。在5 L搅拌式生物反应器中对上述工艺进行成功放大,mAAFP质量浓度达到25 mg/L。之后,利用rProtein A Sepharose Fast Flow介质纯化mAAFP,并通过SDS-PAGE、Western blot验证其纯度,为下一步利用小鼠模型研究蛋白功效和作用机理做好准备。

关键词：融合蛋白瞬时基因表达中国仓鼠卵巢细胞过敏

重组抗HER2人源化单克隆抗体的瞬时表达及其抗肿瘤活性

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中国医药工业杂志 2016年第7期47卷 851-856页

作者：刘东晨洪坡詹显龙夏倩坤谢秋玲暨南大学生命科学技术学院广东省生物工程药物重点实验室基因工程药物国家工程研究中心广东广州510632

利用HEK293F细胞瞬时表达重组抗HER2人源化单克隆抗体(rh HER2-m Ab),优化转染条件,并初步鉴定纯化后的抗体抗肿瘤活性。分别构建rh HER2-m Ab重、轻链表达载体(p CMV-HC和p CMV-LC),采用聚乙烯亚胺(PEI)为转染试剂,共转染重、轻链质粒... 详细信息

利用HEK293F细胞瞬时表达重组抗HER2人源化单克隆抗体(rh HER2-m Ab),优化转染条件,并初步鉴定纯化后的抗体抗肿瘤活性。分别构建rh HER2-m Ab重、轻链表达载体(p CMV-HC和p CMV-LC),采用聚乙烯亚胺(PEI)为转染试剂,共转染重、轻链质粒到HEK293F细胞中进行表达。采用Protein A亲和色谱纯化抗体,以WST-8法检测其体外抗肿瘤效果。经优化后,HEK293F细胞瞬时表达rh HER2-m Ab的最佳条件为:细胞接种密度4×106 cells/ml,DNA浓度2.0?g/106 cells,DNA∶PEI为1∶2,重链∶轻链为1∶1,抗体表达量可达73.0 mg/L,抗体纯度大于98%。rh HER2-m Ab对高表达HER2的乳腺癌BT-474细胞抑制率为(72.3±2.0)%,对中表达HER2的乳腺癌SK-BR-3细胞抑制率约(32.1±1.2)%,但对低表达HER2的乳腺癌MCF-7细胞无显著抑制作用。细胞凋亡试验结果表明,相对于对照组,rh HER2-m Ab对BT-474细胞的凋亡率约25%,对SK-BR-3细胞则近15%。

关键词：重组抗HER2人源化单克隆抗体瞬时基因表达 HEK293F细胞抗肿瘤活性

重组抗人上皮黏附因子人源化单克隆抗体的瞬时表达及体外活性检测

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中国医药工业杂志 2020年第7期51卷 856-865页

作者：王磊边延林朱建伟张宝红上海交通大学药学院细胞工程及抗体药物教育部工程研究中心上海200240

人上皮黏附因子(EpCAM)在多种上皮相关癌症表面过表达,介导肿瘤的增殖、分化、转移及信号传导等多种活动,是一种有潜力的癌症治疗靶点。本研究通过构建哺乳动物细胞表达载体,优化转染条件,使用瞬时基因表达技术在HEK293E细胞中表达了重... 详细信息

人上皮黏附因子(EpCAM)在多种上皮相关癌症表面过表达,介导肿瘤的增殖、分化、转移及信号传导等多种活动,是一种有潜力的癌症治疗靶点。本研究通过构建哺乳动物细胞表达载体,优化转染条件,使用瞬时基因表达技术在HEK293E细胞中表达了重组抗EpCAM人源化IgG1型单克隆抗体(rhEpCAM-mAb)。抗体经纯化后,采用乳酸脱氢酶释放法初步鉴定了其介导的抗体依赖细胞毒作用。结果表明,rhEpCAM-mAb在HEK293E细胞中以DNA∶PEI为1∶5,轻链∶重链为1∶3的最优条件进行瞬时表达时,抗体表达量可达46.05 mg/L,抗体对EpCAM的亲和力为5.56×10-12 mol/L,它对SK-OV-3、SW480和OVCAR-3细胞抗体依赖的细胞毒作用的IC50分别为12.36、5.43、102.90 ng/ml。本研究利用瞬时基因表达技术能够快速获得重组单克隆抗体,并对其生物活性进行研究,为生物技术药物开发及生产提供理论支持。

关键词：人上皮黏附因子重组人源化单克隆抗体瞬时基因表达 HEK293E细胞抗体依赖的细胞毒作用