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幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组体的构建及其表达鉴定

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实用预防医学 2011年第9期18卷 1619-1622页

作者：刘志杰邱宏周秀萍李秀萍湖南省怀化医学高等专科学校湖南怀化418000

目的构建含幽门螺杆菌(Hp)Lpp20基因的真核表达重组体,并鉴定其在Hela细胞中能否有效表达,为进一步开展Lpp20核酸疫苗与该蛋白的生物学功能的研究打下基础。方法抽提Hp标准菌株26695基因组DNA,应用聚合酶链式反应(PCR)技术从基因组DNA扩... 详细信息

目的构建含幽门螺杆菌(Hp)Lpp20基因的真核表达重组体,并鉴定其在Hela细胞中能否有效表达,为进一步开展Lpp20核酸疫苗与该蛋白的生物学功能的研究打下基础。方法抽提Hp标准菌株26695基因组DNA,应用聚合酶链式反应(PCR)技术从基因组DNA扩增Lpp20基因,经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pcD-NA3.1(+),转入大肠杆菌,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应鉴定;用脂质体法将构建好的重组载体pcDNA3.1(+)-Lpp20转染Hela细胞,通过免疫细胞化学法及Western印迹法检测其在Hela细胞中表达的Lpp20蛋白。结果成功扩增出长约528 bp的Lpp20基因,测序结果表明扩增出的Lpp20基因与Hp Lpp20序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实Lpp20基因正确克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),并经免疫细胞化学法和Western印迹法检测到重组体可在Hela细胞中有效表达。结论成功构建了Lpp20基因的Hp真核表达重组体,并检测到其在Hela细胞中可表达出免疫反应性良好的蛋白,为进一步探索其免疫作用及生物学功能奠定了基础。

关键词：幽门螺杆菌真核表达重组体 Lpp20

pEGFP/MOMP真核表达重组体的构建及表达

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中国麻风皮肤病杂志 2005年第7期21卷 509-511页

作者：粟盛梅李忠玉余敏君占利生唐双阳南华大学医学院病原生物学研究所湖南衡阳421001

目的:克隆沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因,构建pEGFP/MOMP真核表达重组质粒,为沙眼衣原体核酸疫苗的研制提供依据。方法:用PCR方法从D型Ct基因组中扩增MOMP全基因片段,克隆入真核表达载体pEGFP相应的酶切位点中,阳性重组子经BamHI、K... 详细信息

目的:克隆沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因,构建pEGFP/MOMP真核表达重组质粒,为沙眼衣原体核酸疫苗的研制提供依据。方法:用PCR方法从D型Ct基因组中扩增MOMP全基因片段,克隆入真核表达载体pEGFP相应的酶切位点中,阳性重组子经BamHI、KpnI双酶切、PCR扩增及测序鉴定;并经脂质体介导转染HeLa细胞,36h后观察瞬时表达情况。结果:PCR扩增得到约1.2kb的特异性MOMP基因片段;序列测定证实与GenBank登录的D型沙眼衣原体一致;筛选鉴定出真核表达重组体pEGFP/MOMP。结论:成功地构建了pEGFP/MOMP真核表达重组体,并在HeLa细胞中表达了MOMP。

关键词：真核表达重组体 pEGFP MOMP 真核表达重组质粒 HeLa细胞沙眼衣原体 PCR扩增主要外膜蛋白真核表达载体全基因片段 PCR方法阳性重组子脂质体介导核酸疫苗表达情况序列测定基因组克隆人 Kpn 特异性 D型酶切鉴定

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人P15基因真核表达重组体的构建和鉴定

中国实验动物学杂志 1996年第3期6卷 151-153页

作者：时伟红金春元张学王太一孙开来中国医科大学实验动物学部遗传室

将含人ｐ１５ｃＤＮＡ质粒ｐＢＳ－ＳＫ－ｐ１５以ＥｃｏＲＩ和ＸｈｏＩ进行双酶切，再与真核表达载体ｐＣＲＴＭ３经相同酶切点连接，转化感受态细菌、筛选、鉴定得到可在真核细胞中表达人ｐ１５基因的重组质粒ｐＣＲ－ｈｐ１５。

关键词： P^15 DNA质粒 p15基因真核表达载体 SK 真核表达重组体鉴定酶切感受态细胞

人胸腺素α1真核表达重组体的构建及其转染人外周血淋巴细胞对后者免疫活性的影响

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浙江大学学报（医学版） 2002年第2期31卷 121-124页

作者：徐峰陈智姚航平何剑琴浙江大学医学院附属第一医院浙江杭州310003

目的 :构建人胸腺素α1(Tα1)真核表达重组体 p BK- Tα1,并研究其转染人外周血淋巴细胞 (PBL)对后者免疫活性的影响。方法 :将已构建的 Tα1克隆重组体 p UC18- Tα1经 Eco R I、Hind 酶切 ,获得 Tα1片段 ,再将其克隆入真核细胞表达... 详细信息

目的 :构建人胸腺素α1(Tα1)真核表达重组体 p BK- Tα1,并研究其转染人外周血淋巴细胞 (PBL)对后者免疫活性的影响。方法 :将已构建的 Tα1克隆重组体 p UC18- Tα1经 Eco R I、Hind 酶切 ,获得 Tα1片段 ,再将其克隆入真核细胞表达载体 p BK- CMV得到 p BK- Tα1重组体 ,p BK- Tα1以脂质体包裹的方法转染 PBL细胞 ,作 RT- PCR在 m RNA水平检测 p BK- Tα1在 PBL细胞中的表达。用 E玫瑰花环试验检测转染 p BK- Tα1后的 PBL细胞中T淋巴细胞表面 E受体的表达情况 ,并以酶联免疫吸附试验检测转染 p BK- Tα1后的 PBL细胞培养上清中的 IFN- γ和 IL- 2值。结果 :构建成功 Tα1真核细胞表达重组体 p BK- Tα1;在 m RNA水平证实 ,p BK- Tα1可在 PBL细胞中得以转录 ;初步证实 p BK- Tα1转染入 PBL细胞可促进 IFN- γ、IL- 2的表达和 T淋巴细胞表面 E受体的产生。结论 :p BK- Tα1在 PBL细胞内的表达可能会增强

关键词：胸腺素淋巴细胞免疫学人胸腺素α1 真核表达重组体人外周血淋巴细胞

大鼠全长OBRbcDNA克隆及真核表达重组体的构建

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安徽医科大学学报 2002年第5期37卷 333-335页

作者：王佑民黎峰程桦傅祖植安徽医科大学第一附属医院内分泌科合肥230022 中山医科大学孙逸仙纪念医院内分泌科广州510120

目的　克隆SD大鼠全长长胞内段瘦素受体基因cD NA(OBRbcDNA)及构建其真核表达重组体 ,为进一步研究该基因打下基础。方法　应用RT PCR方法分段扩增全长OBRbcDNA ,再将它们连接起来 ,并获得载有全长OBRbcDNA的阳性克隆质粒。将上述质粒... 详细信息

目的　克隆SD大鼠全长长胞内段瘦素受体基因cD NA(OBRbcDNA)及构建其真核表达重组体 ,为进一步研究该基因打下基础。方法　应用RT PCR方法分段扩增全长OBRbcDNA ,再将它们连接起来 ,并获得载有全长OBRbcDNA的阳性克隆质粒。将上述质粒中全长OBRbcDNA定向插入真核表达质粒pcDNA3中 ,筛选出阳性克隆。通过限制性内切酶酶切和核苷酸序列测定进行鉴定。结果　重组的克隆质粒和真核表达质粒经限制性内切酶酶切后获得的片段大小均与理论值一致。结论　成功地克隆了SD大鼠全长OBRbcDNA 。

关键词：真核表达重组体瘦素受体基因克隆质粒瘦素

RASSF1A基因转染对人肺腺癌细胞株A549增殖的抑制作用

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中南大学学报（医学版） 2005年第2期30卷 193-196页

作者：邓征浩周建华曹慧秋沈明文继舫中南大学湘雅医学院病理学教研室长沙410078

目的:观察外源性RASSF1A基因对人肺腺癌细胞A549增殖及NF κB亚单位P65表达的影响。方法:利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNA3. 0 RASSF1A质粒和空载体pcDNA3. 0质粒分别导入A549细胞,经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆,Westernbl... 详细信息

目的:观察外源性RASSF1A基因对人肺腺癌细胞A549增殖及NF κB亚单位P65表达的影响。方法:利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNA3. 0 RASSF1A质粒和空载体pcDNA3. 0质粒分别导入A549细胞,经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆,Westernblotting检测RASSF1A基因表达。采用MTT(四甲基偶氮唑盐)法、流式细胞仪分析转染细胞的生物学行为。RT PCR和Westernblotting检测基因转染对P65表达的影响。结果:经脂质体转染和筛选,建立了稳定表达RASSF1A基因的A549细胞系。与未转染组和转染空白载体组比较,转染RASSF1A基因的细胞生长速度明显减慢(P表达明显降低(P表达未见明显变化。结论:RASSF1A基因可能通过抑制P65活性而抑制人肺腺癌细胞A549的生长。

关键词：基因转染细胞株A549 RASSF1A基因抑制作用人肺腺癌肺腺癌细胞A549 增殖 blotting Western pcDNA3 真核表达重组体脂质体转染技术四甲基偶氮唑盐流式细胞仪分析 A549细胞系 RT-PCR mRNA表达 P65 生物学行为 B亚单位

人细胞间黏附分子1cDNA的克隆及表达载体的构建

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中国医师杂志 2005年第5期7卷 617-619页

作者：何艳苏先狮蒋永芳陈军中南大学湘雅二医院肝病研究中心湖南长沙410011

目的构建人细胞间黏附分子-1真核表达重组体pcDNA3.1hisB-ICAM-1。方法设计、合成ICAM-1基因序列特异性引物,从肝癌组织中提取总RNA,以此为模板经RT-PCR扩增人ICAM-1的cDNA片段;然后将其克隆到pGEM-TEasyVector,构建中介重组体(pGEM-ICA... 详细信息

目的构建人细胞间黏附分子-1真核表达重组体pcDNA3.1hisB-ICAM-1。方法设计、合成ICAM-1基因序列特异性引物,从肝癌组织中提取总RNA,以此为模板经RT-PCR扩增人ICAM-1的cDNA片段;然后将其克隆到pGEM-TEasyVector,构建中介重组体(pGEM-ICAM-1),再克隆,构建真核表达重组体pcDNA3.1HisB-ICAM-1,经菌落PCR和限制性酶切有目的片段出现,进行DNA序列分析。结果RT-PCR扩增得到人成熟ICAM-1的cDNA片段大小为1622bp,中介重组体(pGEM-ICAM-1),酶切后与真核表达载体连接,根据酶切鉴定和DNA序列分析得到真核表达重组体pcDNA3.1HisB-ICAM-1;结论成功构建了真核表达重组体pcDNA3.1HisB-ICAM-1。

关键词：克隆真核表达重组体 DNA序列分析 pcDNA3 细胞间黏附分子-1 cDNA片段 ICAM-1 序列特异性引物 pGEM-T 真核表达载体限制性酶切总RNA 肝癌组织酶切鉴定 1基因 PCR 中介