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埃博霉素D对体外培养的孤独症谱系障碍BTBR小鼠皮质神经元兴奋性突触结构的影响

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埃博霉素D对体外培养的孤独症谱系障碍BTBR小鼠皮质神经元兴奋性...

作者：陈永红山西医科大学

学位级别：硕士

目的:以体外培养的BTBR小鼠皮质神元为研究对象,通过培养基中添加微管稳定剂埃博霉素D,考察其对BTBR小鼠皮质神元兴奋性突触结构的影响,进一步探讨微管稳定性参与孤独症谱系障碍发病的作用机制,以期为体内实验研究埃博霉素D对孤独症谱... 详细信息

目的:以体外培养的BTBR小鼠皮质神元为研究对象,通过培养基中添加微管稳定剂埃博霉素D,考察其对BTBR小鼠皮质神元兴奋性突触结构的影响,进一步探讨微管稳定性参与孤独症谱系障碍发病的作用机制,以期为体内实验研究埃博霉素D对孤独症谱系障碍兴奋性突触结构及行为改善提供实验基础及理论依据。方法:1.利用体外培养的方法获得BTBR小鼠原代皮质神经元,并采用MAP2-神经元特异性标记抗体,对所培养的神经元进行免疫荧光法纯度鉴定。2.培养至相对成熟的BTBR小鼠皮质神经元,随机分为埃博霉素D实验组和溶剂对照组。实验组给予10 n M埃博霉素D、溶剂对照组给予相同体积的0.1%DMSO溶剂,于培养箱中继续培养24 h。24 h后弃去培养基,预热的正常培养基分别清洗对照组、实验组细胞各2次,对照组、实验组细胞一组于培养箱中继续培养90 min,另随机选取一组实验组、对照组给予4℃冷刺激90 min。后取出4组细胞,分别给予神经元细胞骨架标志蛋白α-Tubulin免疫荧光标记微管,形态学考察神经元在冷处理干预下的稳定性,并比较微管稳定剂埃博霉素D干预后微管在形态结构方面的稳定性变化。3.条件培养基干预24 h结束后,收集细胞提取总蛋白,免疫印迹技术检测微管稳定的标志蛋白(Acetyl-Tubulin、α-Tubulin)、微管相关蛋白(MAP2、STOP)的表达及兴奋性突触结构前后膜标志蛋白(VGLUT1、PSD95)、谷氨酸受体相关蛋白(Glu N2B、m Glu R5)的表达水平。4.Dil染液标记树突棘,考察埃博霉素D对树突棘密度的影响。5.统计学方法:蛋白表达的比较、树突棘密度结果的差异性比较采用t检验,对所有结果有统计学意义的P值分别为*P皮质神经元微管的冷稳定性及微管稳定的标志蛋白、微管相关蛋白的表达。2.与溶剂对照组相比,10 nM埃博霉素D干预后可以增加BTBR小鼠皮质神经元兴奋性突触结构相关蛋白及谷氨酸受体相关蛋白的表达。3.与溶剂对照组相比,10 nM埃博霉素D干预后可以增加BTBR小鼠皮质神经元的树突棘密度。结论:1.微管稳定剂埃博霉素D能改善体外培养的BTBR小鼠皮质神经元兴奋性突触结构,其机制可能与增加微管稳定性有关。2.这些结果进一步验证了微管稳定性在孤独症谱系障碍发病中的重要作用,为进一步体内实验研究埃博霉素D对孤独症谱系障碍兴奋性突触结构及行为改善提供实验基础和理论依据。

关键词：埃博霉素D 孤独症谱系障碍 BTBR小鼠皮质神经元兴奋性突触

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皮质神经元B27原代培养及MAP2鉴定

沈阳药科大学学报 2013年第1期30卷 40-43页

作者：曹珂刘检苗露阳张予阳沈阳药科大学生命科学与生物制药学院辽宁沈阳110016

目的对原代新生鼠皮质神经元原代培养方法进行改进,以获得纯度更高、体外更易存活的神经元进行相关实验研究。方法采用胰酶消化和机械分离相结合的方法制备皮质神经元悬液,进行培养,用倒置相差显微镜观察细胞形态,利用神经元特异性标志... 详细信息

目的对原代新生鼠皮质神经元原代培养方法进行改进,以获得纯度更高、体外更易存活的神经元进行相关实验研究。方法采用胰酶消化和机械分离相结合的方法制备皮质神经元悬液,进行培养,用倒置相差显微镜观察细胞形态,利用神经元特异性标志物微管相关蛋白2(MAP2)鉴定培养神经元的纯度。结果神经元细胞存活率高,在体外培养条件下细胞状态良好,生长旺盛。培养第4天,可见多数细胞长出1、2个突起并交织成网。培养第8天细胞胞体较大,能形成典型的神经细胞网络。培养第10天,鉴定神经元纯度质量分数达90%以上。结论该方法简便可行,是体外培养神经元较理想的方法。

关键词：大鼠原代培养皮质神经元鉴定

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梓醇对大脑皮质神经元的抗衰老保护作用研究

中国药理学通报 2017年第12期33卷 1691-1697页

作者：王静欢刘珂万东祝慧凤西南大学药学院暨中医药学院中药药理学实验室重庆400715 重庆医科大学附属第一医院急诊医学科&重症医学科重庆400016

目的探讨梓醇对正常皮质神经元的抗衰老作用及其可能机制。方法原代培养新生24 h SD大鼠皮质神经元,分为正常组、梓醇低(0.1 mg·L^(-1))、中(1 mg·L^(-1))、高(10 mg·L^(-1))剂量组。上述培养基中的神经元培养至13 d,显微观察7~13 d... 详细信息

目的探讨梓醇对正常皮质神经元的抗衰老作用及其可能机制。方法原代培养新生24 h SD大鼠皮质神经元,分为正常组、梓醇低(0.1 mg·L^(-1))、中(1 mg·L^(-1))、高(10 mg·L^(-1))剂量组。上述培养基中的神经元培养至13 d,显微观察7~13 d的各组细胞形态;MTT法检测7~13 d各组细胞的细胞活力;免疫荧光分别检测13 d各组神经元pS6和Map-2表达以显示细胞的内在活性和轴突生长情况;Western blot法检测13 d各组细胞GAP-43、p-S6、PI3K、pPI3K、Akt、p-Akt、m TOR、p-m TOR蛋白的表达。结果与正常组相比,梓醇给药各组均能延缓神经元的衰老,促进神经元的存活,提高神经元的细胞活力(P神经元内在活性,促进p-S6阳性细胞数增加(P神经元GAP-43、p-S6、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、m TOR、p-m TOR蛋白表达增加(P皮质神经元衰老作用,其机制可能与调控PI3K/Akt/m TOR信号通路,增强神经元生长活性有关。

关键词：梓醇皮质神经元抗衰老细胞活性轴突生长 PI3K/Akt/mTOR

睡眠呼吸暂停间歇性低氧对体外培养胚鼠皮质神经元的影响

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临床耳鼻咽喉头颈外科杂志 2015年第9期29卷 845-848页

作者：张婵娟李延忠王岩山东大学齐鲁医院耳鼻咽喉科卫生部耳鼻咽喉重点实验室济南250012

目的:检测不同模式间歇性低氧对体外原代培养的胚鼠皮质神经元活性及凋亡的影响,探讨睡眠呼吸暂停间歇性低氧在认知功能损害中的作用。方法:原代培养胚鼠皮质神经元细胞并行免疫荧光鉴定。培养神经元随机分为间歇性低氧组、间歇性正常... 详细信息

目的:检测不同模式间歇性低氧对体外原代培养的胚鼠皮质神经元活性及凋亡的影响,探讨睡眠呼吸暂停间歇性低氧在认知功能损害中的作用。方法:原代培养胚鼠皮质神经元细胞并行免疫荧光鉴定。培养神经元随机分为间歇性低氧组、间歇性正常氧组、持续性低氧组及空白对照组,间歇性低氧组根据频率及时限的不同分为5个亚组。不同模式的低氧下暴露神经元,分别采用MTT比色法及DAPI染色法对神经元的活性及凋亡进行检测。结果:间歇性低氧各亚组与持续性低氧组之间对神经元活性及凋亡的影响均差异有统计学意义(P神经元活性及凋亡的影响差异无统计学意义(P>0.05)。结论:低氧程度及低氧累积时间相同条件下,间歇性给氧方式较持续性给氧方式对神经元活性及凋亡影响显著;间歇性低氧可引起神经元活性及凋亡的显著改变,可能是OSAHS患者认知损害的重要原因。

关键词：间歇性低氧睡眠呼吸暂停低通气综合征阻塞性皮质神经元

过氧化氢损伤原代皮质神经元中PPARγ的改变

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中华医学杂志 2015年第21期95卷 1686-1690页

作者：王宁韩晶徐艳炜梁浩程焱孙莉天津医科大学总医院 300052 天津市神经病学研究所教育部"中枢神经系统创伤修复与再生"重点实验室300052 天津市"神经损伤变异与再生"重点实验室 300052

目的在原代培养皮质神经元中,观察过氧化氢（H2 O2）损伤是否诱导了过氧化物酶体增殖物激活受体γ （PPARγ）的磷酸化修饰及活性改变,从调节PPARγ的角度探讨H2 O2的损伤机制.方法体外原代培养SD大鼠皮质神经元,完全随机分为正常对... 详细信息

目的在原代培养皮质神经元中,观察过氧化氢（H2 O2）损伤是否诱导了过氧化物酶体增殖物激活受体γ （PPARγ）的磷酸化修饰及活性改变,从调节PPARγ的角度探讨H2 O2的损伤机制.方法体外原代培养SD大鼠皮质神经元,完全随机分为正常对照组、H2O2损伤组（分别给予250、500、750 μmol/L H2O2作用2h）、U0126（ERK1/2激活抑制剂）组（10 μmol/L U0126预处理30min后给予500 μmol/L H2O2作用2h）,采用细胞形态学观察、MTT法测定细胞存活率、锥虫蓝染色测定细胞死亡率、Western印迹法检测PPARγ、p-PPARγ（磷酸化的PPARγ）蛋白表达水平及PPARγ的核移位（即PPARγ活性）的改变.结果（1）与正常对照组相比,经不同浓度（250、500、750 μmol/L） H2O2损伤2h后,神经元相对存活率降低（74.8％±5.2％、53.6％±6.7％和26.5％±5.8％,均P＜0.05）,死亡率增加（正常对照组6.6％±1.0％,H2 O2损伤组23.1％±2.8％、48.2％±4.1％、75.9％±4.4％,均P＜0.05）.（2）与正常对照组相比,H2O2 500μmol/L损伤组神经元PPARγ蛋白表达无明显变化（正常对照组1.25±0.07,H2 O2损伤组1.16±0.08,t=1.44,P＞0.05）,而p-PPARγ蛋白表达增加（正常对照组0.90 ±0.04,H2O2损伤组1.26±0.09,t=-6.48,P＜0.05）.同时PPARγ胞质蛋白表达增加（正常对照组0.49±0.04,H2O2损伤组0.77±0.03,t=-10.35,P＜0.05）,胞核蛋白表达下降（正常对照组0.76±0.03,H2 O2损伤组0.20±0.06,t=14.82,P＜0.05）（即核移位下降）.（3）与H2 O2损伤组相比,抑制ERK1/2激活降低p-PPARγ蛋白表达水平（H2O2损伤组0.85±0.05,U0126组0.42±0.14,t =4.91,P＜0.05）、增加PPARγ核移位（胞质损伤组1.03±0.16,U0126组0.60±0.04,t=4.58,P＜0.05;胞核损伤组0.16±0.04,U0126组0.87±0.11,t=-10.41,P＜0.05）,同时增加神经元存活率（70.8％±1.3％,P＜0.05）,降低神经元死亡率（29.8％±3.4％,P＜0.05）.结论原代皮质神经元中,PPARγ的磷酸化参与了H2 O2的细胞损伤机制.

关键词： H2O2 PPARγ 磷酸化皮质神经元

下调miR-205抑制皮质神经元的缺血性损伤

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神经解剖学杂志 2018年第1期34卷 60-66页

作者：阎雯蔡玉香西安市儿童医院新生儿一科西安710000

目的:探讨miR-205对皮质神经元缺氧/缺糖损伤的作用与其可能的作用机制。方法:大鼠大脑皮层神经细胞的分离培养和MAP2免疫荧光鉴定皮质神经元。缺氧/缺糖处理构建皮质神经元缺血性损伤模型。实时荧光定量PCR检测miR-205表达量。利用Lipo... 详细信息

目的:探讨miR-205对皮质神经元缺氧/缺糖损伤的作用与其可能的作用机制。方法:大鼠大脑皮层神经细胞的分离培养和MAP2免疫荧光鉴定皮质神经元。缺氧/缺糖处理构建皮质神经元缺血性损伤模型。实时荧光定量PCR检测miR-205表达量。利用Lipofectamine2000转染miR-205 mimics,miR-205抑制剂或LRP-1 siRNA。试剂盒检测caspase-3活性。Annexin-V fluorescein isothiocyanate conjugate and propidium iodide(Annexin-V FITC/PI)方法检测细胞凋亡。MTT实验检测细胞生长活力。双荧光素酶报告基因检测miR-205与LRP-1的靶向调控关系。Western Blot检测LRP-1蛋白表达量。结果:MAP2鉴定为皮质神经元。皮质神经元缺氧/缺糖损伤下调miR-205表达量。细胞转染实验中,下调miR-205显著抑制损伤模型的细胞凋亡和caspase-3活性,提高细胞生长活力;过表达miR-205则作用相反。对于miR-205的靶向基因LRP-1,过表达miR-205可显著抑制LRP-1,而抑制miR-205其作用则相反。同时抑制miR-205和LRP-1促进损伤模型的细胞凋亡和caspase-3活性,降低细胞生长活力。结论:下调miR-205可以通过调控LRP-1抑制皮质神经元的缺血性损伤,为新生儿脑卒中的预防和治疗提供一定的理论基础。

关键词：新生儿脑卒中 miR-205 LRP-1 皮质神经元缺氧/缺糖

Epothilone D对体外培养的BTBR小鼠皮质神经元兴奋性突触结构的影响

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解剖学杂志 2022年第3期45卷 222-227页

作者：陈永红杨桦刘永峰雷强蔚洪恩山西医科大学第五临床医学院神经内科太原030012 山西医科大学基础医学院太原030012

目的 :探讨微管稳定剂埃博霉素D(Epo D)对孤独症谱系障碍BTBR小鼠皮质神经元兴奋性突触结构的影响及机制。方法 :体外培养BTBR小鼠原代大脑皮质神经元,免疫荧光法检测所培养神经元的纯度;培养至相对成熟的BTBR小鼠皮质神经元随机分为实... 详细信息

目的 :探讨微管稳定剂埃博霉素D(Epo D)对孤独症谱系障碍BTBR小鼠皮质神经元兴奋性突触结构的影响及机制。方法 :体外培养BTBR小鼠原代大脑皮质神经元,免疫荧光法检测所培养神经元的纯度;培养至相对成熟的BTBR小鼠皮质神经元随机分为实验组(Epo D组)、溶剂对照组(0.1%DMSO)干预24 h,再冷处理90min后行微管免疫荧光染色,观察微管的形态变化;免疫印迹检测微管稳定的标志蛋白(acetyl-tubulin、α-tubulin)、微管相关蛋白(MAP2、STOP)的表达,及兴奋性突触结构前、后膜标志蛋白(VGLUT1、PSD95)、兴奋性谷氨酸受体相关蛋白(GluN2B、mGluR5)的表达水平。结果 :与对照组相比,10 nmol/L的Epo D可增加BTBR小鼠皮质神经元微管的冷稳定性及微管稳定的标志蛋白、微管相关蛋白的表达;可以增加BTBR小鼠皮质神经元兴奋性突触结构、兴奋性谷氨酸受体相关蛋白的表达,差异均有统计学意义。结论 :微管稳定剂Epo D能改善体外培养的BTBR小鼠皮质神经元兴奋性突触结构,其机制可能与增加微管稳定性有关。

关键词：皮质神经元兴奋性突触埃博霉素D 孤独症谱系障碍 BTBR小鼠

RAB3GAP1异常表达对小鼠皮质神经元细胞蛋白质组的影响研究

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RAB3GAP1异常表达对小鼠皮质神经元细胞蛋白质组的影响研究

作者：刘燕晨重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:越来越多的研究表明,RAB3GAP1在具有多种神经生物学功能和过程的大脑疾病过程中被修饰,并且是一个潜在的重要靶点。然而,对于RAB3GAP1的异常表达所引起的细胞水平和分子水平的变化尚不完全清楚。为了更深入地了解Rab3GAP1可能作为... 详细信息

目的:越来越多的研究表明,RAB3GAP1在具有多种神经生物学功能和过程的大脑疾病过程中被修饰,并且是一个潜在的重要靶点。然而,对于RAB3GAP1的异常表达所引起的细胞水平和分子水平的变化尚不完全清楚。为了更深入地了解Rab3GAP1可能作为重要的疾病靶点的调控机制,我们对Rab3GAP1失调引起的蛋白表达变化进行了全面的研究。方法:首先通过慢病毒质粒转染小鼠神经元细胞构建小鼠皮质神经元RAB3GAP1过表达或者干扰细胞系。然后我们利用基于与生物信息学分析结合的i TRAQ(isobaric tag for relative and absolute quantitation)定量蛋白质组学方法进行组间交叉比较,发现了一些RAB3GAP1直接调控的候选靶蛋白。进一步的平行反应监测(parallel reaction monitoring,PRM)分析深入的探讨了RAB3GAP1表达异常对小鼠皮质神经元蛋白质组的影响。结果:与干扰对照组相比,RAB3GAP1干扰组中共鉴定到364个差异蛋白;与过表达对照组相比,RAB3GAP1过表达组中鉴定出了314个差异蛋白。生物信息学分析结果表明,RAB3GAP1干扰和过表达诱导产生的蛋白质组功能表达谱不同,暗示了其生物学过程和产生的细胞效应存在的潜在差异。组间交叉比较发现了一些RAB3GAP1直接调控的候选靶蛋白,平行反应监测(parallel reaction monitoring,PRM)分析表明,Sub1、Ssrp1和Top1蛋白可能在RAB3GAP1介导的皮质神经元自噬通路中发挥新的重要作用。结论:Sub1、Ssrp1和Top1可能是皮质神经元中RAB3GAP1介导的自噬通路中的一些新的潜在的重要中间蛋白。此外,本研究还发现Krt77作为细胞骨架蛋白的表达水平与RAB3GAP1的表达异常密切相关。根据结果可以推测Krt77蛋白可能参与了RAB3GAP1调控的轴突转运过程。然而,相关的分子机制,特别是基于RAB3GAP1的神经元自噬的分子机制需要进一步的研究。

关键词： RAB3GAP1 皮质神经元 iTRAQ PRM 定量蛋白质组学

13-甲基十四烷酸对氧反常诱导大鼠胚脑皮质神经元凋亡和形态学损伤的保护作用

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解剖学报 2015年第1期46卷 25-31页

作者：余涓胡桂芳翁绳美巢苹福建医科大学基础医学院生理学与病理生理学系药学院药理学系福州350004

目的探讨13-甲基十四烷酸(13-MTD)对氧反常诱导大鼠胚脑皮质神经元凋亡和形态学损伤的保护作用。方法原代培养大鼠胚脑皮质神经元,并以神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫荧光法鉴定。将神经细胞随机分为正常对照组、模型组和不同剂量13-MTD... 详细信息

目的探讨13-甲基十四烷酸(13-MTD)对氧反常诱导大鼠胚脑皮质神经元凋亡和形态学损伤的保护作用。方法原代培养大鼠胚脑皮质神经元,并以神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫荧光法鉴定。将神经细胞随机分为正常对照组、模型组和不同剂量13-MTD组,每组设6个复孔。氧糖剥夺3h/再复氧糖24h(OGD3h/R24h)方法制备神经元氧反常模型,于再复氧糖即刻分别给予13-MTD 5、10、20、40mg/L干预。倒置相差显微镜下观察神经细胞形态改变;磺酰罗丹明B(SRB)法测定神经细胞存活率;吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)染色法观察神经细胞凋亡;透射电子显微镜下观察神经元超微结构的改变。结果与正常组比较,模型组神经元呈现病理改变,神经细胞存活率显著下降(P神经元超微结构损伤明显,可见核内染色质边集或凝聚成块状,胞质内细胞器明显减少甚至消失,线粒体肿胀、嵴断裂甚至消失等;与模型组比较,不同剂量的13-MTD可有效改善上述变化(P神经元形态及其超微结构损伤明显恢复,且存在剂量依赖关系,以13-MTD 20mg/L改善更显著(P皮质神经元损伤具有明显保护作用,其可能通过改善神经细胞形态和线粒体超微结构损伤,减少神经元凋亡,提高细胞存活率。

关键词： 13-甲基十四烷酸氧反常超微结构损伤皮质神经元免疫荧光大鼠