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广东省蒲瓜病毒种类鉴定及多重RT-PCR检测方法的建立

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中国农业科学 2023年第23期56卷 4684-4695页

作者：苏琦汤亚飞佘小漫蓝国兵于琳吴正伟李正刚何自福广东海洋大学滨海农业学院广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室

【目的】探明侵染广东省蒲瓜的病毒种类，建立一种可以同时检测多种蒲瓜病毒的RT-PCR检测方法，提高蒲瓜病毒种类鉴定效率，为蒲瓜病毒病的精准监测与防控提供依据。【方法】2018—2022年间，从广东省广州市、惠州市、清远市、汕头市和... 详细信息

【目的】探明侵染广东省蒲瓜的病毒种类，建立一种可以同时检测多种蒲瓜病毒的RT-PCR检测方法，提高蒲瓜病毒种类鉴定效率，为蒲瓜病毒病的精准监测与防控提供依据。【方法】2018—2022年间，从广东省广州市、惠州市、清远市、汕头市和湛江市的蒲瓜主要种植区采集蒲瓜病毒病疑似样品78份，对采集的样品按照地区和症状进行分类，提取每份样品的总RNA，将一个地区具有相同症状样品的RNA等量混合后进行小RNA深度测序分析。根据小RNA深度测序分析结果，设计特异引物进行RT-PCR验证，从而明确侵染广东省蒲瓜的病毒种类。挑选6种检出率高、危害严重的蒲瓜病毒，根据GenBank数据库设计多重PCR检测引物，通过优化反应体系和反应条件，建立同时检测6种蒲瓜病毒的多重RT-PCR方法。【结果】从采集的78份蒲瓜疑似病毒病样品中，共检测到12种病毒，按照检出率从高到低分别为葫芦内源RNA病毒（Lagenaria siceraria alphaendornavirus,LSEV）(64.1%)、黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）(62.8%)、小西葫芦虎纹花叶病毒（zucchini tigre mosaic virus,ZTMV）(51.3%)、西瓜绿斑驳花叶病毒（watermelon green mottle mosaic virus,WGMMV）(43.6%)、西瓜病毒A(watermelon virus A,WVA)(32.1%)、番木瓜环斑病毒（papaya ringspot virus,PRSV）(19.2%)、小西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）(9.0%)、瓜类蚜传黄化病毒（cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV）(7.7%)、中国南瓜曲叶病毒（squash leaf curl China virus,SLCCNV）(7.7%)、瓜类褪绿黄化病毒（cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV）(5.1%)、瓜类黄矮失调病毒（cucurbit yellow stunting disorder virus,CYSDV）(3.8%)、甜瓜黄斑病毒（melon yellow spot virus,MYSV）(1.3%)。78份样品中，复合侵染率高达80.8%，其中2、3、4、5、6和7种病毒复合侵染的检出率分别为14.1%、16.7%、23.1%、17.9%、7.7%和1.3%。在多重RT-PCR体系中先加入WVA+CCYV+ZTMV+PRSV引物，12个反应后再加入CGMMV+WGMMV引物，引物体积依次为WVA 0.5μL、CCYV 0.5μL、CGMMV 0.4μL、WGMMV 0.4μL、ZTMV 0.6μL、PRSV 0.6μL，从而确立了一种同时扩增6种病毒的多重RT-PCR检测方法。【结论】危害广东省蒲瓜的主要病毒有12种，其中CGMMV、ZTMV、WGMMV、WVA为优势病毒；复合侵染现象较普遍，以3、4和5种病毒的复合侵染形式占比较高；研发出一种同时检测蒲瓜上6种病毒的多重RT-PCR检测技术，提高了蒲瓜病毒种类鉴定效率。

关键词：蒲瓜病毒病小RNA深度测序 RT-PCR检测多重PCR方法

病毒病对三七中皂苷生物合成的影响及三七响应病毒的分子机理

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病毒病对三七中皂苷生物合成的影响及三七响应病毒的分子机理

作者：陈虹均昆明理工大学

学位级别：硕士

三七[Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen]是我国中药材中的一颗明珠,具有很高的药用价值,在云南文山州一带大规模种植。但由于三七生长周期长,且常年来遭受真菌、细菌、病毒等多种病害的胁迫,严重阻碍了三七产业的可持续发展。因而迫切... 详细信息

三七[Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen]是我国中药材中的一颗明珠,具有很高的药用价值,在云南文山州一带大规模种植。但由于三七生长周期长,且常年来遭受真菌、细菌、病毒等多种病害的胁迫,严重阻碍了三七产业的可持续发展。因而迫切需要深入研究病毒病对三七生长发育的影响以及三七响应病毒病的机理。在先前关于三七病毒病的报道中,只有少量研究运用形态学观察及血清学分析等传统手段鉴定了几种三七病毒病的病原,并没有关于三七抗病毒侵染分子机制方面研究。因此本课题采用小RNA深度测序技术(Deep sequencing of small RNAs)对云南文山州境内的具有失绿、花叶、麻点症状的感病三七进行病毒鉴定。此外,利用实时荧光定量PCR技术建立病毒的快速检测体系,以提供更为快捷准确的病毒检测手段。同时分析了病毒病对三七皂苷(P.notoginseng saponins,PNS)的生物合成以及光合作用造成的影响。最后,通过转录组测序、蛋白组及代谢组学分析研究三七与病毒的互作机制,进而为三七病毒病的防治工作提供理论基础。本论文得到的主要结果如下:1、通过对三种症状的感病三七进行s RNA深度测序,鉴定出三七A病毒(Panax notoginseng virus A,Pn VA)与人参潜隐病毒4(Panax cyrptic virus 4,PCV4),并利用RT-PCR验证了两种病毒的存在,同时在透射电子显微镜中发现了可能的球状病毒颗粒。基于人参潜隐病毒的RNA依赖的RNA聚合酶基因序列的系统发育分析,推测PCV4属于阿尔法分裂病毒(alphapartitivirus)?此外,建立了Pn VA、PCV4两种病毒的q PCR检测方法,此方法相比常规RT-PCR检测方法,具有更加准确与灵敏的优点,同时该检测方法还具有高特异性与重复性。2、在皂苷生物合成方面,失绿、花叶、麻点症状的三七中3-羟基-3-甲基戊二酰合成酶(HMCAS)与鲨烯环氧酶(SE)等关键酶的基因相对表达量与健康三七(对照)相比明显下调,几种单体皂苷的含量也降低。其中,失绿三七皂苷合成受病毒抑制作用最大,花叶三七受影响最小。在光合作用方面,三种症状的三七中二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)、果糖1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)等光合作用相关基因的表达水平均下调,光合作用参数如叶绿素含量以及Rubisco等酶的酶活也明显降低。3、此外,基于转录组测序、蛋白质组和代谢组差异分析,初步研究了三七与病毒互作机制。转录组测序中差异表达基因主要富集在植物激素信号转导、植物-病原体互作、MAPK信号途径等几条通路中;在蛋白组学分析中,卟啉和叶绿素代谢、光合作用、氧化磷酸化等途径的差异蛋白最为丰富;在代谢组学中,ABC转运蛋白、硫代葡萄糖苷生物合成以及淀粉和蔗糖代谢等通路的差异代谢物富集程度最高。基于代谢通路的多组学联合分析表明病毒侵染抑制了三七的光合作用、糖代谢等生理途径,并推测超敏反应、氧化磷酸化、水杨酸与茉莉酸信号途径参与了三七对病毒的防御反应。总之,通本论文研究的结果丰富了三七病毒病病原的鉴定方法与检测手段,更深入地认识了病毒病对三七生长发育的影响。此外,多组学联合分析初步揭示了三七与病毒互作的分子机制,有利于今后三七病毒病防治工作的开展。

关键词：三七病毒病小RNA深度测序 qPCR 皂苷生物合成多组学联合分析

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鱼类疱疹病毒研究进展概述

水产学报 2022年第2期46卷 322-336页

作者：赵哲喻飞郝凯李舒馨张小东陈泓迅河海大学海洋学院海洋生物系

疱疹病毒是双链DNA病毒家族成员之一，具有高度的传染性，严重危及人类及动物的健康；其中异疱疹病毒科各成员是引起水生动物病害的主要病原，严重制约全球水产养殖业的健康发展，尤其对我国鱼类养殖产业影响巨大。本文简要概述鱼类疱... 详细信息

疱疹病毒是双链DNA病毒家族成员之一，具有高度的传染性，严重危及人类及动物的健康；其中异疱疹病毒科各成员是引起水生动物病害的主要病原，严重制约全球水产养殖业的健康发展，尤其对我国鱼类养殖产业影响巨大。本文简要概述鱼类疱疹病毒研究发展历程、现状及进展，主要包括鲤疱疹病毒、鮰疱疹病毒、鲑疱疹病毒及其他鱼类疱疹病毒等，以期增强我们对鱼类疱疹病毒研究发展的系统性认知。

关键词：水生动物鱼类病毒病疱疹病毒

广西辣椒病毒的sRNA深度测序和RT-PCR鉴定

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园艺学报 2022年第5期49卷 1060-1072页

作者：龚明霞赵虎王萌吴星赵曾菁何志黄金梅孟生德王日升广西壮族自治区农业科学院蔬菜研究所广西蔬菜育种与新技术研究重点实验室南宁530007 甘肃省敦煌种业集团股份有限公司甘肃酒泉735008

采用小RNA(sRNA)深度测序技术,结合RT-PCR技术对广西9个辣椒主产区具有典型病毒病症状的病样进行检测,共发现10种病毒,其中小米椒内源RNA病毒1(Capsicum frutescens endornavirus 1,CFEV 1)、辣椒潜隐病毒2(pepper cryptic virus 2,PCV... 详细信息

采用小RNA(sRNA)深度测序技术,结合RT-PCR技术对广西9个辣椒主产区具有典型病毒病症状的病样进行检测,共发现10种病毒,其中小米椒内源RNA病毒1(Capsicum frutescens endornavirus 1,CFEV 1)、辣椒潜隐病毒2(pepper cryptic virus 2,PCV 2)、烟草轻型绿花叶病毒(tobacco mild green mosaic virus,TMGMV)和辣椒黄脉病毒(pepper vein yellows virus,PeVYV)是在广西辣椒上首次发现,且CFEV 1在中国是首次发现。10种病毒在75份辣椒病样中的总检出率为8.00%~66.67%,前5位依次为辣椒脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus,ChiVMV,66.67%)、甜椒脉斑驳病毒(pepper veinal mottle virus,PVMV,62.67%)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV,41.33%)、CFEV 1(32.0%)以及PCV 2(26.67%)。ChiVMV、PVMV、CMV和CFEV 1在广西7~9个辣椒主产区广泛分布,推测为优势病毒。除桂林外,其他8个辣椒主产区均含以上4种优势病毒中的1~3种,但在桂林,这4种病毒的检出率偏低或检不出,其优势病毒种类是PMMoV和PCV 2。广西辣椒病毒病复合侵染率为94.66%,3种(检出率42.67%)和4种(检出率24.00%)病毒复合侵染是主要形式。3种复合侵染中以ChiVMV+PVMV+CMV和ChiVMV+CFEV 1+ChiRSV占比最高(均为18.75%),4种复合侵染中以ChiVMV+PVMV+CMV+CFEV 1占比最高(16.67%)。

关键词：辣椒病毒病小RNA 深度测序 RT-PCR 分子鉴定

3个苹果新品种病毒病的发生状况及ASSVd序列分析

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果树学报 2023年第6期40卷 1215-1225页

作者：陈荣鑫钟远闻孙鲁龙王辉王伯臣贾荣俭赵政阳西北农林科技大学园艺学院陕西杨凌712100

【目的】近年来,苹果病毒病的发生日趋严重,对产业的健康发展造成了严重影响,但是其在苹果新品种瑞阳、瑞雪、瑞香红上的发病状况尚不明确。【方法】在2021—2022年采用RT-PCR方法对白水地区198份新品种样品进行病毒病检测,并对感染苹... 详细信息

【目的】近年来,苹果病毒病的发生日趋严重,对产业的健康发展造成了严重影响,但是其在苹果新品种瑞阳、瑞雪、瑞香红上的发病状况尚不明确。【方法】在2021—2022年采用RT-PCR方法对白水地区198份新品种样品进行病毒病检测,并对感染苹果锈果类病毒(apple scar skin viroid,ASSVd)植株的果实症状进行了调查和基因克隆、测序。【结果】检测结果显示白水地区新品种潜隐性病毒的感病率显著高于非潜隐性病毒,其中苹果褪绿叶斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)的检出率最高,达到了91.72%,其次是苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)和苹果茎痘病毒(apple stem pitting virus,ASPV),检出率分别达到了77.16%、37.13%,苹果坏死花叶病毒(apple necrotic mosaic virus,ApNMV)的检出率为30.31%,苹果锈果类病毒和苹果凹果类病毒(apple dimple fruit viroid,ADFVd)的检出率接近10%;通过对新品种携带病毒类型分析发现,新品种瑞阳整体的检出率低于瑞雪和瑞香红,且73.17%植株病毒复合侵染种类以2~3种为主,而瑞雪、瑞香红57.55%、69.39%的植株以3~4种为主;3个新品种感染苹果锈果类病毒后,瑞阳主要表现为“花脸型”,瑞雪、瑞香红表现为“花脸型”“果面凹凸不平”2种症状;通过对3个新品种ASSVd分离物进行测序、分析,发现新品种瑞阳分离物与伊朗苹果分离物(KM213397.1)同属一个分支,新品种瑞雪、瑞香红分离物序列与韩国、加拿大苹果分离物(AF421195.1、X71599.1)同属一个分支。【结论】检测结果表明,白水地区3个新品种苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎沟病毒感病率较高,非潜隐性病毒的感病率相对较低,且新品种瑞阳对病毒的敏感性较低;新品种瑞雪、瑞香红苹果锈果类病毒分离物属于同一分支,而它们拥有共同的亲本(克氏粉红×秦富1号),这从寄主亲缘关系远近的角度表明ASSVd侵染存在寄主特异性。

关键词：苹果新品种病毒病 RT-PCR检测 ASSVd

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海南西番莲主要病毒种类的分子检测与鉴定

园艺学报 2022年第8期49卷 1785-1794页

作者：陈礼浪杨天章蔡儒平林小漫邓南康车海彦林雅婷孔祥义三亚市热带农业科学研究院海南三亚572000 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所海口571101

2020年5—7月,在海南三亚市和五指山市采集表现花叶、皱缩、畸形等疑似病毒病的西番莲叶片样品176份,通过PCR和RT-PCR检测发现:侵染西番莲的病毒主要为黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、南瓜蚜传黄化病毒(cucurbit aphid-borne... 详细信息

2020年5—7月,在海南三亚市和五指山市采集表现花叶、皱缩、畸形等疑似病毒病的西番莲叶片样品176份,通过PCR和RT-PCR检测发现:侵染西番莲的病毒主要为黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、南瓜蚜传黄化病毒(cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)、东亚西番莲病毒(East Asian Passiflora virus,EAPV)、夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus,TeMV)、西番莲木质化病毒(passion fruit woodiness virus,PWV)、西番莲斑驳病毒(Passiflora mottle virus,PaMV)和番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)。TeMV的检出率最高,为52.27%;其次为PaMV,43.75%;CMV和EAPV均为28.98%;PWV为22.73%;TYLCV为9.09%;CABYV为4.55%。TeMV、PaMV、CMV、EAPV和PWV可能是三亚和五指山西番莲的主要病毒,样品病毒复合侵染率为78.91%,存在32种复合侵染类型,以2~4种病毒复合侵染为主。3个TYLCV西番莲分离物的基因组全长均为2781 bp,含6个ORF。序列相似性和系统进化分析结果表明:3个分离物均属于TYLCV-Israel株系,序列相似性为98.85%~99.14%,与海南已报道的4个其他作物上的分离物聚在同一进化分支上。这是TYLCV侵染西番莲的首次报道。

关键词：西番莲病毒病病原检测番茄黄化曲叶病毒

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马铃薯病毒病病原RT-PCR分子鉴定

新疆农业科学 2023年第12期60卷 3032-3040页

作者：杨茹薇刘易李江涛古丽米拉·热合木土拉罗正乾徐琳黎沈洪飞新疆农业科学院综合试验场乌鲁木齐830012

【目的】研究中国新疆马铃薯主产区的病毒病发病种类,分析该区域马铃薯主要病毒病原,为马铃薯病毒病科学防治提供科学依据。【方法】2021年在我国新疆马铃薯主产区乌鲁木齐县、吉木萨尔县、奇台县、巴里坤县、泽普县采集马铃薯病毒病疑... 详细信息

【目的】研究中国新疆马铃薯主产区的病毒病发病种类,分析该区域马铃薯主要病毒病原,为马铃薯病毒病科学防治提供科学依据。【方法】2021年在我国新疆马铃薯主产区乌鲁木齐县、吉木萨尔县、奇台县、巴里坤县、泽普县采集马铃薯病毒病疑似感病样本87份,并对样本进行RT-PCR检测,对于阳性样本的CP基因进行克隆及测序,完成同源性、地理来源和系统进化分析。【结果】从87份样本中检测到马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV),检出率分别为100%、37.93%、6.89%,以PVY检出率最高,未检出马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、马铃薯M病毒(Potato virus M,PVM),PVY是危害该区域马铃薯样本的主要病毒病原。试验对PVY阳性带病样本进行克隆与序列比对,其中5份样本CP基因序列与中国(福建、山东、江苏)及波兰等地分离物一致性达到100%,与其他国家的分离物的一致性达到99.04%以上。【结论】我国新疆马铃薯主产区主要由PVY、PVS、PLRV的一种或多种病毒所侵染,其中PVY病原较严重。

关键词：马铃薯病毒病分子检测系统进化

基于宏病毒组测序技术的苹果病毒病鉴定与分析

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园艺学报 2022年第7期49卷 1415-1428页

作者：夏炎黄松武雪莉刘一琪王苗苗宋春晖白团辉宋尚伟庞宏光焦健郑先波河南农业大学园艺学院郑州450002 信阳农林学院河南信阳464001

采用宏病毒组测序技术(Virome Sequencing Technology)对河南地区染病苹果树进行病毒检测与分析,从建库测序的苹果叶片中共检测出13种病毒,其中有5种苹果病毒:苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(apple stem p... 详细信息

采用宏病毒组测序技术(Virome Sequencing Technology)对河南地区染病苹果树进行病毒检测与分析,从建库测序的苹果叶片中共检测出13种病毒,其中有5种苹果病毒:苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(apple stem pitting virus,ASPV)、苹果褪绿叶斑病毒(apple chlorotic leafspotvirus,ACLSV)、苹果坏死花叶病毒(applenecroticmosaicvirus,Ap NMV)和苹果绿皱缩相关病毒(apple green crinkle associated virus,AGCa V)。对病毒检测结果中的5种苹果病毒进行RT-PCR验证,扩增后均获得目的条带,与宏病毒组测序检测结果一致,表明宏病毒组测序检测结果精准可靠。根据测序结果设计特异性引物对ASPV全长进行扩增,得到1条长度为9246 nt的ASPV-HN分离物基因组,与NCBI数据库中已报道的19个ASPV分离物的基因组核苷酸序列一致性为75.48%~79.85%;宏病毒组测序拼接所得的两条长度均为6475 nt的ASGV基因组全长基因ASGV-HN1和ASGV-HN2,与NCBI数据库中已报道的18个ASGV分离物的基因组核苷酸序列一致性为79.98%~98.08%。对53份河南不同产区的苹果叶片样品进行苹果花叶病毒(apple mosaic virus,Ap MV)和Ap NMV的检测,结果显示花叶病症样品中均检测出Ap NMV,未检测到Ap MV,表明Ap NMV可能是引起河南地区苹果花叶病的主要病原。

关键词：苹果病毒病宏病毒组测序技术 RT-PCR 检测苹果花叶病

利用小RNA深度测序技术鉴定江苏盐城辣椒病毒种类

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江苏农业学报 2023年第1期39卷 37-43页

作者：赵小慧刘冲郁凯钟明娟郑佳秋邢锦城江苏沿海地区农业科学研究所江苏盐城224002 诸城市农业农村局山东诸城262200

2019年6月江苏省盐城市发生了较为严重的辣椒病毒病,危害症状表现为植株重度矮化、叶片黄化、蕨叶甚至畸形。将采集的11株疑似感染病毒的辣椒植株叶片研磨成浆液,再用其摩擦接种本氏烟植株,发现用其中3株辣椒的叶片浆液摩擦接种本氏烟... 详细信息

2019年6月江苏省盐城市发生了较为严重的辣椒病毒病,危害症状表现为植株重度矮化、叶片黄化、蕨叶甚至畸形。将采集的11株疑似感染病毒的辣椒植株叶片研磨成浆液,再用其摩擦接种本氏烟植株,发现用其中3株辣椒的叶片浆液摩擦接种本氏烟植株后,本氏烟植株出现病毒侵染的典型症状,初步判断这些辣椒被病毒感染,但不能确定其种类和归属。为了进一步明确辣椒感染的病毒类型,将3株辣椒样品混成2份样品利用小RNA深度测序技术和生物信息学分析法进行检测,结果发现样品1被蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)、苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus,AMV)和辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)3种病毒复合侵染,从样品2中检测到BBWV21种病毒,通过RT-PCR检测验证了这一结果的可靠性。最后利用RT-PCR方法对田间采集的11份辣椒样品和接种的本氏烟植株进行毒源鉴定,其中2株辣椒样品及其接种的本氏烟叶片上鉴定出了BBWV2、ChiVMV和AMV,这3种病毒侵染辣椒在江苏省均为首次发现。研究结果为对江苏省辣椒构成潜在严重威胁的病毒的早期诊断和及时防控提供了参考。

关键词：辣椒小RNA深度测序病毒病